響應面法優化采油用蠟狀芽孢桿菌發酵配方

馬 樂，羅梓軒，姬文鈺

（1.中國石油長慶油田分公司第一采油廠，陜西西安 710200；2.長慶化工集團慶陽分公司，甘肅慶陽 715000；3.長慶（寧夏）精細化工有限公司，寧夏銀川 750000）

微生物采油技術是指將微生物注入油層，微生物在油層中生長及代謝作用于原油，改變原油的一些物化性質，從而提高原油采收率的技術[2]。該技術的采油機理是微生物能將石油烷烴作為碳源而生長繁殖，其生長代謝產生的酶可降解原油的組分，從而降低了原油黏度，增加了流動性；產生的生物表面活性劑、有機溶劑、生物氣等通過改變油水界面張力、巖石的潤濕性，改善注入水的驅替效率，提高洗油效率；當微生物在高滲地層生長繁殖達到一定數量，密集成團、成膜或代謝產生的多糖類形成生物聚合物時，可選擇性堵塞微細孔道，改變水流方向，擴大注水的掃油面積，提高波及系數，達到調剖作用，增加原油產量[3]。微生物采油技術具有成本低、適應性廣和環保等特點[4]，因而越來越受到人們的重視，其應用前景非常廣闊；目前微生物采油進入了一個新的發展時期，微生物采油技術已在全球大量應用[5-11]。

經過前期的工作，從長慶采油一廠的油水樣中，分離并篩選得到了一株能高效降解石油烴類物質的細菌，通過鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Latin Name Bacillus cereus Frankland and Frankland）。該菌細胞呈直桿狀，有成鏈趨勢，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛。屬于化能異養菌，在營養瓊脂固體培養基表面，菌落粗糙、暗白色、不透明。鄧振山等[11]研究報道過利用蠟狀芽孢桿菌及其代謝產物處理石油污染，降解率達到90.23 %。

培養基組分對微生物生長特別重要，對于微生物制劑而言，活菌數的含量是其質量保證的重要因素之一。本文采用響應面法對蠟狀芽孢桿菌的發酵培養基進行了優化，確定了其最佳配方，為工業化生產奠定了基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料 蠟狀芽孢桿菌（km121），由本實驗室分離并保存。

1.1.2 實驗試劑 牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司生產；氯化鈉，天津市鼎盛鑫化工有限公司生產；瓊脂粉、氯化鈣，國藥集團化學試劑有限公司生產；鹽酸、氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司生產；葡萄糖、硫酸銨，西安化學試劑廠；尿素，內蒙古博大實地化學有限公司；硫酸鎂、磷酸二氫鈉，天津市科密歐化學有限公司；磷酸氫二鉀，天津市天力化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 干燥箱（型號為101A-1），中華人民共和國上海市實驗儀器總廠生產；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號為DH-101-2BS），天津市中環實驗電爐有限公司生產；實驗室pH 計（型號為PHSJ-4A），上海儀電科學儀器股份有限公司生產；立式壓力蒸汽滅菌鍋（型號為LDZH-75KBS），上海申安醫療器械廠生產；隔水式電熱恒溫培養箱（型號為PYX-DHS-40×50-BS-Ⅱ），上海躍進醫療器械有限公司生產；臺式恒溫振蕩器（型號為THZ-82A），上海躍進醫療器械有限公司生產；分析天平（型號為AL204），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司生產。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基 牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，初始pH 值為6.8～7.2。

1.2.2 種子培養基 牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，初始pH 值為6.8～7.2。

1.2.3 發酵培養基 葡萄糖20 g/L，尿素1 g/L，硫酸銨1 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鈉2.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，氯化鈣0.02 g/L。初始pH 值為6.8～7.2。

以上培養基滅菌條件均:121 ℃，20 min。

1.3 培養方法

1.3.1 種子活化 將蠟狀芽孢桿菌（km121）轉接到斜面培養基上，37 ℃培養20 h。

1.3.2 種子培養 挑一環斜面種子接種于500 mL 三角瓶種子培養基中，裝液量為100 mL，37 ℃，120 r/min振蕩培養20 h。

1.3.3 發酵培養 將種子液以5 %接種量接種于三角瓶發酵培養基中，裝液量為100 mL，37 ℃，120 r/min振蕩培養24 h。

1.4 Plackett-Burman 設計

采用Plackett-Burman 進行實驗設計，篩選蠟狀芽孢桿菌（km121）基礎發酵培養基中的顯著因子，對培養基的8 個組分，葡萄糖（A），尿素（B），硫酸銨（C），硫酸鎂（E），磷酸二氫鈉（F），磷酸氫二鉀（G），酵母膏（J），氯化鈣（K）進行全面考察。選擇10 因子2 水平的實驗設計，增加2 個虛擬項D，H 來估計實驗誤差，每個因子取高低2 個水平（見表1）。

1.5 爬坡實驗

通過對1.4 的實驗結果進行分析，確定蠟狀芽孢桿菌（km121）基礎發酵培養基的主要因子，根據回歸方程和各因子的系數來確定主要因子的爬坡路徑和步長[12]。改變三種組分的質量濃度，使其成梯度變化檢測發酵液活菌數量，快速確定最大響應值的區域。

表1 Plackett-Burman 設計因子與水平

1.6 響應面分析

通過1.5 的結果確定了影響蠟狀芽孢桿菌（km121）濃度的3 個主要因子，爬坡實驗確定了3 個主要影響因子的響應區域，采用Box-Behnken 的中心組合設計原理，設計3 因素3 水平的響應面分析實驗，最終確定最佳發酵培養基組分。

1.7 蠟狀芽孢桿菌濃度測定方法

采用平板菌落計數法測發酵液濃度。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 設計

篩選顯著因子采用Plackett-Burman 設計對基礎發酵培養基的8 個組分進行分析，各組分分別取高低2個水平（見表2），各因子水平方差分析結果（見表3）。

表2 Plackett-Burman 設計及響應值

表3 Plackett-Burman 設計顯著因子分析

S=0.404 145 PRESS=23.52

R-Sq=99.98 % R-Sq（預測）=96.60 % R-Sq（調整）=99.74 %

利用Minitab16 軟件對表2 中的實驗數據進行分析，得到回歸模型方差分析和各因素的主效應結果（見表3），該模型的P 值為0.002＜0.05，說明該模型顯著，能較好擬合數據。由表3 中P 值的大小可以判定，培養基中各因子對蠟狀芽孢桿菌（km121）活菌數影響的重要性排序為J＞B＞A＞F＞C＞E＞G＞K。虛擬項D、H 的P 值較大，說明不顯著，未知因素對實驗結果的影響較小。酵母膏、尿素和葡萄糖3 個因子的P 值均小于0.05，說明其對蠟狀芽孢桿菌（km121）活菌數有顯著影響，因此選定酵母膏、尿素和葡萄糖作為下一步實驗的關鍵因素。

2.2 爬坡實驗結果

根據2.1 實驗結果來設計實驗，實驗結果（見表4）。當酵母膏濃度為1 g/L，尿素為1.5 g/L，葡萄糖濃度為20 g/L 時，活菌數達到最大值，所以以此為中心點進行響應面實驗分析。

2.3 響應面實驗設計及結果

利用Design Expert 軟件，根據Box-Behnken 中心組合設計原理，設計了3 因素3 水平的響應面實驗，響應面實驗設計及實驗結果（見表5），將表5 實驗數據進行多元回歸擬合，獲得活菌數對編碼自變量酵母膏，尿素，葡萄糖的二次多項回歸方程：R1=50.06+1.74×A-0.11×B+1.71×C+0.075×A×B+0.25×A×C+2.42×B×C-0.86×A2-3.32×B2-2.27×C2

2.3.1 交互項對實驗結果的影響

（1）酵母膏和尿素對菌濃的影響（見圖1）。

（2）酵母膏和葡萄糖對菌濃的影響（見圖2）。

（3）尿素和葡萄糖對菌濃的影響（見圖3）。

由圖1～圖3 可以看出，等高線為橢圓形，說明交互作用顯著。等高線的疏密可以看出酵母膏和尿素對菌濃的影響＞酵母膏和葡萄糖對菌濃的影響＞尿素和葡萄糖對菌濃的影響。

表4 爬坡實驗設計及結果

表5 響應面設計實驗結果

圖1 響應面法（酵母膏和尿素）立體分析及等高線圖

圖2 響應面法（酵母膏和葡萄糖）立體分析及等高線圖

圖3 響應面法（尿素和葡萄糖）立體分析及等高線圖

2.3.2 響應面分析法對菌液濃度的ANOVA 分析（見表6）由表6 可知本實驗相關系數為0.973 7，決定系數為0.920 8，說明因素水平選擇合理，二次多項回歸方程的P 值小于0.000 1，說明模型顯著，回歸方程失擬檢驗P 值為0.564 5＞0.05，說明失擬項不顯著，未知因素對實驗結果干擾小。擬合檢驗顯著，說明所建立的模型是有效的與實際情況擬合，3 種參數對菌液濃度的影響是顯著的。

表6 響應面分析法對菌液濃度的ANOVA 分析

2.4 最終優化結果

為進一步確定最佳點，利用Design Expert-8.0.6軟件程序對蠟狀芽孢桿菌（km121）培養基進行優化，可得最佳方案為：酵母膏為1.5 g/L，葡萄糖為22.67 g/L，尿素1.09 g/L。在此條件下，軟件程序對發酵液活菌數的預測值為51.46×108cfu/mL。為了實際的操作方便，將葡萄糖改為22.7 g/L，尿素1.1 g/L，在此條件下實際實驗值為51.2×108cfu/mL，絕對誤差為0.05 %。因此采用修正后的方法得到的提取參數準確可靠，具有實用價值。

3 結論

該研究采用Plackett-Burman 設計從蠟狀芽孢桿菌（km121）基礎發酵培養基中的8 個組分中篩選出3個顯著因子：葡萄糖（A）、尿素（B）和酵母膏（J），然后利用爬坡實驗快速找到最大響應區，并用響應面分析法的Box-Behnken 設計確定顯著因子的最優配比：酵母膏1.5 g/L，葡萄糖22.67 g/L，尿素1.09 g/L，最終確定了蠟狀芽孢桿菌（km121）的最優培養基配方:葡萄糖22.7 g/L，尿素1.1 g/L，硫酸銨1 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鈉2.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，酵母膏1.5 g/L，氯化鈣0.02 g/L，經驗證實驗檢測結果準確可靠，具有實用價值，生物量比優化前的33.2×108cfu/mL 提高了35.2 %，并且培養基成本低，成分簡單，適合大規模發酵生產。