雙孢菇貯藏不同時期乙醇處理對其保鮮作用研究

劉錦，李云云，程圣，何欣遙，張敏

(西南大學 食品科學學院，西南大學食品貯藏與物流研究中心，農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715)

雙孢菇因其味道好，營養高，已成為世界上最廣泛栽培及食用的菌種[1]。但雙孢菇呼吸作用強，菌體易腐敗[2]。根據市場調研，雙孢菇需要在不同地點收集后統一貯藏，由于地點不同，收集時間分散，經銷商很有可能不方便對蘑菇進行入庫前統一處理，因此探討收入冷庫后再處理的方式對蘑菇品質的影響，尋找替代入庫前處理的方法具有現實操作意義。

目前對于雙胞菇采后貯藏保鮮措施有氣調保鮮[3]、臭氧處理[4]、輻照保鮮[5]、涂膜保鮮[6]以及化學藥劑處理[7]等。乙醇作為植物天然代謝物[8]，無毒無害，不易殘留，應用到果蔬中能夠殺滅微生物[9]，抑制呼吸作用從而起到保鮮效果[10]。同時乙醇便宜易得，熏蒸操作簡單，揮發后無殘留，更安全、更容易為消費者接受。HAN等[11]用濃度為6 mL/kg乙醇處理西蘭花，結果顯示乙醇能有效抑制西蘭花貯藏階段失重率；WANG等[12]以乙醇蒸氣熏蒸枇杷，發現乙醇能有效抑制真菌引起的炭疽病；劉洪麗[13]的研究證明乙醇能有效減弱鮮切荸薺呼吸強度；WANG等[14]以濃度為150～750 μL/L乙醇熏蒸鮮切菊芋，發現菊芋的呼吸強度、PAL酶活和總酚含量的上升趨勢得到顯著抑制。有研究表明，入庫前乙醇處理菇類能夠有效改善其采后品質[15]，但目前乙醇處理時間主要集中在入庫前，有關乙醇處理時期的研究極為匱乏。所以本文研究乙醇處理的不同時期對雙孢菇保鮮品質的影響，在經銷商沒有時間進行入庫前處理的情況下，尋找一種補救措施以延長雙孢菇的保鮮期。

1 材料與方法

1.1 材料

從北碚種植戶得到無病蟲害和機械損傷的雙孢蘑菇，要求種植戶采后8 h內運送至實驗室。

1.2 儀器與設備

Headspace analyzer，Pac Check?Model 650EC，US MOCON)；色差儀，UltraScan?PRO，HunterLab,USA；UV 分光光度計 (UV-2450PC)，島津制作所。

1.3 樣品處理

挑選尺寸接近，無病害，無機械損傷，處于閉傘階段的雙孢菇進行處理，試驗共有4組，每組3個平行。

A組：入庫前對A組進行乙醇熏蒸處理(乙醇濃度400 μL/L，時間3 h)，熏蒸溫度保持25 ℃。熏蒸完畢，通風半小時后保持溫度在2～4 ℃預冷0.5 h，最后分裝到統一體積PE袋(每袋100 g)，共21袋放入冷庫(溫度2～4 ℃，濕度95%)貯藏12 d，每隔1 d隨機取3袋檢測指標。

B組：入庫后即分裝至PE袋(每袋100 g)貯藏12 d，冷庫溫度2～4 ℃，濕度95%。貯藏第4天重復A組熏蒸處理，從入庫開始每隔1 d隨機取3袋檢測指標。

C組：入庫后即分裝至PE袋(每袋100 g)貯藏12 d，冷庫溫度2～4 ℃，濕度95%。貯藏第8天重復A組熏蒸處理，從入庫開始每隔1 d隨機取3袋檢測指標。

CK組：入庫后即分裝至PE袋(每袋100 g)貯藏12 d，冷庫溫度2～4 ℃，濕度95%。從入庫開始每隔1 d隨機取3袋檢測指標。

1.4 測定指標

1.4.1 呼吸強度

通過頂空分析儀靜置法[16]測定。呼吸強度以每小時每千克雙孢蘑菇在呼吸代謝過程中釋放的CO2的質量表示。

1.4.2 PAL(phenylalamine ammonialyase)活性

參考曹健康等[17]方法。以每小時每克(鮮重)菇肉組織酶促反應體系吸光度值增加0.01為1個PAL活性單位(U)。

1.4.3 總酚含量

參照ZHOU等[18]方法。以每克(鮮重)菇肉組織在波長280 nm處吸光度值表示總酚含量(U)。

1.4.4 PPO(polyphenol oxidase)活性

參考OMS-OLIU等[19]方法并略做修改。以每克果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加0.01為一個活性單位。

1.4.5 POD(perxidase)活性

參考MOERSCHBACHER等[20]方法并稍作修改。在470 nm處測吸光度值，以每克果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)，計算POD活性。

1.4.6 相對電導率

參考蔣冬花等[21]方法。以蘑菇的相對電導率值來表示其相對電導率。

1.4.7 菌落總數

參照GB/T 4789.2—2016[22]測定菌落總數，結果以lgCFU/g表示。

1.4.8 硬度

參考JIANG等[23]方法。硬度用美國CT-3型質構儀測定，探頭直徑為5 mm，將雙孢蘑菇去柄，菌蓋上切掉2 mm厚的表皮，將切好的雙孢蘑菇固定在操作臺上，保持雙孢蘑菇切面與探頭接觸面平行，探頭以2 mm/s的穿刺速率進行下壓，下壓深度為6 mm，通過力與時間的作用曲線，以最大峰值(Nmax)為硬度指標。

1.4.9 白度

參考JAWORSKA等[24]方法，略有改動，L*值越大表示白度越大。

1.4.10 感官評價

由經過培訓的6人對雙孢蘑菇的色澤、質地、異味等感官指標進行評定。感官指標評定標準如表1所示。

表1 雙孢蘑菇感官指標評價標準Table 1 Standard of sensory properties

1.5 數據分析

采用Microsoft Excel 2010 進行數據整理，用SPSS 13.0、LSD法對各項指標進行顯著性分析，顯著性水平為0.05。Origin 2016對數據進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 不同時期乙醇處理對雙孢菇呼吸強度的影響

雙孢菇作為呼吸躍變型園藝產品，采摘后得不到能量補充，只能通過呼吸作用消耗自身有機物以獲得能量。呼吸作用產生大量水汽和呼吸熱滋生細菌，影響雙孢蘑菇商品性和耐貯性。根據圖1，處理組和對照組雙孢菇呼吸強度均上升到第2天后下降。A組雙孢菇的呼吸峰值顯著低于CK組(P<0.05)。B組在第4天處理后呼吸強度短暫上升至第6天，這可能是B組熏蒸處理時從冷柜中轉移出來，溫度上升，也可能是重新包裝后新包裝內高氧氣促進了雙孢菇的呼吸強度。

B組呼吸強度從第6天開始迅速減少，并在第10天與CK組有極明顯差異(P<0.05)，呼吸強度明顯低于A組(P<0.05)，這可能是由于乙醇對部分細菌有即時殺滅作用，從而抑制菇上微生物呼吸作用，也可能是因為乙醇使呼吸作用酶失活[25]。同時有研究表明，乙醇能降低乙烯合成相關酶活性以減弱雙胞菇呼吸作用[26]。B組處理時間居中，乙醇在貯藏末期殘留較A組多，故而維持呼吸作用酶較低活性的效果優于A組。C組與CK組在整個貯藏過程中沒有差異，或許是因為后期乙醇熏蒸對雙孢菇作用不大。綜上，A、B組處理后均能有效減弱呼吸作用，C組則作用不大。

圖1 不同時期乙醇處理對雙孢菇呼吸強度的影響Fig.1 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on respiration rate of Agaricus bisporus

2.2 不同時期乙醇處理對雙孢菇PAL活性的影響

PAL酶催化L-苯丙氨酸并同時生成酚類物質從而導致雙孢菇褐變[27]，失去商品價值。根據圖2，各組PAL活性貯藏前2天持續增強，也許是樣品去根導致了逆境脅迫[28]。從第4天開始，A組PAL酶活明顯降低、并與CK組之間存在極顯著差異(P<0.01)直到貯藏結束，這可能是由于乙醇能夠迅速抑制PAL的mRNA合成，從而降低其活性。乙醇處理萵苣[29]也得出相似結論。

與CK組相比，B組從第8天開始，C組從第12天開始能極顯著抑制PAL的活性(P<0.01)，但二者效果不如A組(P<0.05)。C組從第10天開始與B組沒有顯著差異(P>0.05)。總之，A組能很好的抑制PAL活性(P<0.01)，B組、C組也能很好的抑制后期PAL活性，但不能達到A組的效果。

圖2 不同時期乙醇處理對雙孢菇PAL活性的影響Fig.2 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on PAL activity of Agaricus bisporus

2.3 不同時期乙醇處理對雙孢菇總酚含量的影響

酚類物質是酶促褐變的底物之一[30]，過高的總酚含量會使雙孢菇易褐變。如圖3所示，處理組和對照組總酚含量均先增加后降低，也許是外源乙醇減弱PAL酶活，即減少酚類產生。這與王慧倩等對鮮切西蘭花進行乙醇熏蒸處理得到的趨勢類似[31]。各組前2 d酚類含量的上升可能是因為去根脅迫誘導了PAL活性提高[32]。第2天以后，各組總酚含量持續下降，可能是由于PPO活性一直存在導致總酚不斷消耗，也可能是因為是總酚作為氫供體參與了自由基清除[33]。在整個貯藏期間A組能夠顯著降低總酚含量(P<0.01)。B組總酚從第4天開始迅速降低，第6天開始與CK組存在顯著差異(P<0.05)，這時B組PPO、POD活性并未上升，總酚含量迅速下降的原因可能是本實驗中PAL活性的下降。B組第10天、C組第12天開始與CK組存在極顯著差異(P<0.01)，但與A組差異不大(P>0.05)。總之，A、B、C組都能降低總酚含量，但3個處理組之間沒有顯著差異。

圖3 不同時期乙醇處理對雙孢菇總酚含量的影響Fig.3 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on total polyphenols content of Agaricus bisporus

2.4 不同時期乙醇處理對雙孢菇PPO的影響

PPO是一種導致蘑菇采后褐變的重要蛋白酶[34]。PPO酶能催化酚類形成醌類[35]，從而使得雙孢菇產生褐變降低商品價值。根據圖4，各組PPO活性在貯藏前2 d上升很快，可能是因為去根處理導致膜結構遭到破壞，PPO活性增強以催化木質素及其他酚類物質氧化產物的生成，對傷口形成屏障[36]。A組第6天，B組第8天，C組第10天開始與CK組有明顯區別(P<0.05)，這可能是因為乙醇熏蒸處理抑制了PAL酶活，也就抑制了酚類物質的合成，減少了PPO作用底物故而抑制其活性，也有可能是因為乙醇分子和PPO作用底物有類似化學解離特性的羥基，通過與底物共同爭奪酶活性中心基團以降低PPO活性[37]，但是A、B組之間一直并不存在顯著性差異(P>0.05)，可能是因為貯藏前4 d 各組PPO活性均上升，掩蓋了部分乙醇熏蒸的效果。貯藏結束時，所有處理組與對照組都存在極顯著差異(P<0.01)，B組抑制PPO效果較A組稍差但差異不大，C組效果最差(P<0.05)。總之，3個處理組均可減弱PPO活性并且A，B組效果相當。

圖4 不同時期乙醇處理對雙孢菇PPO活性的影響Fig.4 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on PPO activity of Agaricus bisporus

2.5 不同時期乙醇處理對雙孢菇POD的影響

POD酶在有過氧化氫存在時可以氧化酚類成醌類，導致雙孢菇褐變[38]。各組POD活性總體呈上升趨勢，但存在波動。A組在貯藏前4 d未能顯著抑制抑制雙孢菇POD酶活性(P>0.05)，可能是因為處理時操作破壞了細胞組織膜結構，細胞中游離態POD增加。與CK相比，A組第6天開始能顯著抑制POD活性(P<0.05)，第8天開始A組達到了極顯著水平(P<0.01)。

圖5 不同時期乙醇處理對雙孢菇POD活性的影響Fig.5 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on POD activity of Agaricus bisporus

2.6 不同時期乙醇處理對雙孢菇相對電導率的影響

相對電導率可以表征細胞膜完整度，相對電導率越大，細胞完整度越低[40]。根據圖6，各組相對電導率隨時間總體上升，這可能是因為雙胞菇貯藏期間組成細胞壁的果膠大量降解，導致細胞結構被破壞。A組從第6天開始顯著抑制了雙孢菇的相對電導率(P<0.05)到貯藏結束，而B組需要從第8天開始才能顯著抑制相對電導率(P<0.05)，但與A組差異不大(P>0.05)。第12天，A、B組均可以極顯著減弱相對電導率上升趨勢(P<0.01)，A、B組之間無明顯區別，也許是因為活性氧的產生受到了抑制，保護了細胞。C組也能顯著抑制雙孢菇相對電導率的上升(P>0.05)，但由于乙醇在第8天才處理，活性氧已經在相當長的時間內對細胞造成了傷害，故而效果不如A、B組。由此可見，A、B、C組都能很好地抑制雙孢菇相對電導率的上升，并且B組和A組效果相當。

圖6 不同時期乙醇處理對雙孢菇相對電導率的影響Fig.6 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on relative conductivity of Agaricus bisporus

2.7 不同時期乙醇處理對雙孢菇菌落總數的影響

雙孢菇作為食用菌，其子實體營養豐富且無角質層，易滋生細菌。乙醇對微生物有致死作用，這是因為乙醇可以破壞菌體蛋白的肽鍵，使其變性，同時乙醇還具有溶菌作用[41-43]。根據圖7，各組菌落總數在貯藏期間呈增加趨勢。與CK組相比，A組第0 d菌落總數下降了1.19 lg CFU/g，并且在貯藏期間二者差異極顯著(P<0.01)，這可能是因為乙醇熏蒸對雙孢菇有直接的殺菌作用。B組經乙醇熏蒸處理后菌落總數立刻下降了1 lg CFU/g，從第4天開始到第12天與CK組存在非常明顯差別(P<0.01),但與A組差異不大。C組第8天的菌落總數下降了1.14 lg CFU/g，與CK組存在極顯著差異(P<0.01)直到貯藏結束。貯藏結束時，A組、B組、C組分別達到7.11、7.29、7.26 lg CFU/g，3個處理組之間沒有顯著差異(P>0.05)。由此可見，乙醇不同處理時間均可以有效抑制菌落生長(P<0.01)，且3個處理組之間差異不大(P>0.05)。

圖7 不同時期乙醇處理對雙孢菇菌落總數的影響Fig.7 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on total bacterial counts of Agaricus bisporus

2.8 不同時期乙醇處理對雙孢菇硬度的影響

硬度是果蔬貯藏質量的標志，對消費者購買欲有重要影響，乙醇通過抑制雙孢菇的呼吸強度能夠保持較好的硬度。根據圖8可知，雙孢菇硬度值隨著時間延長不斷下降，這可能是因為雙孢菇呼吸消耗大量有機物。與CK組相比，A組從第2天開始顯著抑制雙孢菇硬度下降直到貯藏結束(P<0.05)，也許是因為A組從第2天開始呼吸作用受到抑制。B、C組經乙醇熏蒸后與CK組差異不大(P>0.05)甚至略有下降，可能是因為雙孢菇乙醇熏蒸時從4 ℃環境轉移到常溫，溫度上升引起硬度下降，這與郭禹等[39]對馬鈴薯的研究結果類似，也有可能是因為B組、C組經乙醇熏蒸后呼吸作用略有加劇導致硬度下降。第12天，A組與CK組存在顯著差異(P<0.05)，但B、C兩組與CK組差異不大(P>0.05)。A組能很好地抑制雙孢菇硬度值的下降(P<0.05)，B組、C組則不能起到明顯作用。

圖8 不同時期乙醇處理對雙孢菇硬度的影響Fig.8 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on firmness of Agaricus bisporus

2.9 不同時期乙醇處理對雙孢菇白度的影響

白度是消費者購買雙孢菇時重要的指標，當L*值小于80時，從外觀上來說雙孢菇喪失了商品價值[40]。根據圖9，雙孢菇的白度值在貯藏過程中不斷下降。與CK組相比，A組從第4天開始顯著抑制白度的下降(P<0.05)，并從第6天開始達到極顯著效果(P<0.01)。B組從第6 d開始顯著抑制白度的下降(P<0.05)，第10天開始達到極顯著效果(P<0.01)，且B組與A組第6天后沒有顯著差異(P>0.05)，說明乙醇熏蒸能夠即時起到保護雙孢菇白度值的作用，也許是因為乙醇熏蒸能明顯減弱PPO、POD酶活以及相對電導率、總酚上升速率。C組雙孢菇白度值從第10天開始下降，但與CK組相差不大(P>0.05)。第8天乙醇熏蒸對白度作用較小，可能是C組樣品呼吸強度已經無明顯減弱。由此可見，A組在貯藏期間顯著抑制雙孢菇白度值的下降(P<0.05)，B組在貯藏中后期顯著維持了白度值(P<0.05)并且在第12天略高于A組(P>0.05)，這與本實驗中B組能在貯藏末期更好抑制PPO和POD酶活的結果保持一致。C組能在后期抑制雙孢菇白度值的下降，但是與CK組沒有顯著差異(P>0.05)，這可能是因為C組后期未能有效抑制POD酶活以及相對電導率的上升。

圖9 不同時期乙醇處理對雙孢菇白度的影響Fig.9 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on whiteness of Agaricus bisporus

2.10 不同時期乙醇處理對雙孢菇感官評價的影響

根據圖10，在貯藏期間雙孢菇的感官評價分值不斷下降。與CK組相比，A組從第4天開始顯著抑制了感官品質的劣變(P<0.05)并在第6天達到極顯著水平(P<0.01)。B組第6天開始顯著抑制了感官品質的劣變(P<0.05)直到貯藏結束。第8天開始CK組和C組出現肉眼可見的褐變，氣味改變，手感發黏而A、B氣味和手感正常，可能是乙醇抑制了A、B組微生物的生長并維持PPO、POD較低活性。第10天，CK組得分僅5.5。C組略高于CK組。第12天，A、B兩組得分分別為6.5、6.25分。綜上，與CK組相比，A、B兩組保持雙孢菇感官評價效果較好(P<0.01)，且A、B作用相當(P>0.05)，而C組與CK組不存在顯著性差異(P>0.05)。

圖10 不同時期乙醇處理對雙孢菇感官評價的影響Fig.10 Effect of ethanol treatment used at different times during storage on sensory properties of Agaricus bisporus

3 結論

本研究表明，與入庫前乙醇熏蒸處理相比，貯藏前期(第4天)對雙孢菇進行乙醇熏蒸處理雖然在抑制PAL活性和維持硬度方面效果略差，但是仍然可以保持其較低的相對電導率、總酚含量和菌落總數，抑制PAL、PPO、POD的活性，維持較高的白度值和感官評價。貯藏前期處理(第4天)抑制雙孢菇后期呼吸強度效果最好。而貯藏后期(第8天)處理雖能更好抑制貯藏后期PPO的活性，但在呼吸強度、白度、硬度、感官評價方面效果不好。綜上所述，對于雙胞菇來說乙醇入庫前處理效果最好，貯藏前期處理(第4天)雖無法完全達到入庫前處理的效果，但依然能保持很好的商品性。對于商家來說，即使不同采收時間，不同地域送來的雙孢菇需要分批進入冷庫，在其貯藏第4天才處理，效果依然會不錯，但不建議在貯藏后期也就是第8天才進行處理。