白藜蘆醇對小鼠非酒精性脂肪性肝炎相關肝細胞癌的治療作用及機制研究

田國燕 顧磊 楊勁

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fattty liver disease,NAFLD）疾病譜包括單純性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver,NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）以及相關的肝纖維化/肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）等[1]。近年來，NAFLD已成為歐美等發達國家HCC的主要病因，高達58.5%[2]。在我國平均隨訪6、7年的NAFLD臨床研究中發現 7.8‰（3/383）患者進展為 HCC[3]。在NAFLD整個疾病自然進程中，NASH是NAFL發展為HCC的限速步驟，有更高的肝癌罹患率，因此加強對NASH相關HCC（NASH-HCC）發病機制及干預措施研究具有非常重要的現實意義。白藜蘆醇（resveratrol,RSV）作為一種中藥虎杖提取物，具有抗脂肪變、抗炎、抗纖維化、保護心血管和抗腫瘤等多種生物學活性，能改善高脂飲食誘導的NASH小鼠肝臟脂肪變[4]，降低老年NASH小鼠肝臟炎癥因子的表達，減輕肝纖維化[5]，誘導肝癌細胞凋亡[6]等。但具體機制尚不完全清楚。膽汁酸作為信號分子在調控能量平衡、炎癥及腫瘤中起重要作用[7]。研究表明RES能夠減少肝內膽固醇的淤積和增加膽汁酸池的大小，通過增加膽固醇7-羥化酶（CYP7A1）的表達促進肝臟膽汁酸合成，進而抑制動脈粥樣硬化的形成，但具體作用機制還不十分清楚[8]。本研究旨在探究白藜蘆醇對NASH-HCC模型小鼠的治療作用及分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料 8周齡SPF級C57BL/6J雌雄小鼠共24只，體重（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2016-0011。白藜蘆醇（北京欣熙源生物科技有限公司，貨號R21350），溶媒：0.9%氯化鈉溶液，鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司，貨號：S0130，規格 100mg）；油紅 O 染色液（珠海Baso 公司，貨號：BA4081，規格：100mg）；TRIZOL 試劑（美國Ambion公司，貨號：15596-026）；膽汁酸標準品（美國Steraloids公司和加拿大TRC Chemicals公司）。日立7180全自動生化分析儀（日本日立公司），7900HT型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystem公司），超高效液相色譜串聯質譜聯用儀（美國Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 1雄2雌配籠生育小鼠，出生后第4天的小鼠每只背部皮下注射STZ 200μg，4周齡時選取雄性小鼠，按隨機數字表法分為STZ+普通飼料組、STZ+高脂高膽固醇飼料（high fat and high cholesterol,HFHC）組和STZ+HFHC+RSV組3組，每組10只。STZ+HFHC+RSV組按400mg/kg灌胃，1次/d，STZ+普通飼料組和STZ+HFHC組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，自由飲用高壓滅菌水。飼料：（1）普通飼料；（2）高脂高膽固醇（high fat and high cholesterol,HFHC）飼料（貨號：D12079B，美國 Research Diet公司），具體配方為：20%蛋白質、50%碳水化合物、21%脂肪和0.21%膽固醇。

1.2.2 小鼠處死及標本采集 于16周齡時稱體重（BW），取血以備血清生化指標和膽汁酸檢測，脫臼處死取肝組織，稱肝臟濕重，并計算肝指數（Liver Index），肝指數=肝重/體重×100%。

1.2.3 血清生化指標測定 摘取小鼠眼球取血，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清中空腹血糖（FPG）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等生化指標。

1.2.4 肝組織腫瘤壞死因子（TNF）-α、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、I型膠原蛋白（Collagen Type I）、轉化生長因子-β（TGF-β）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（GPC3）及膽汁酸受體法尼醇X受體（FXR）、小異二聚體伴侶（SHP）和膽汁酸鹽輸出泵（BSEP）mRNA表達水平測定 采用RT-PCR法。取大約100mg肝組織，加入1ml TRIZOL，研磨，12 000r/min、4℃離心 5min，提取總 RNA，逆轉錄成cDNA，ABI prism 7900 HT熒光定量PCR儀進行PCR擴增，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對水平，引物序列為：TNF-α 上游引物 3′-AAGGGAGAGTGGTCAGG-5′，下游引物 3′-TCTGTGAGGAAGGCT-5′；MCP-1 上游引物 3′-TCCCAATGAGTAGGCTG-5′， 下 游 引 物 3′-TCTGGACCCATTC-5′；Collagen Type I 上游引物 3′-ACCTGTGTGTTCCCTAC-5′， 下 游 引 物 3′-GACTGTTGCCTTCGCCT-5′；GPC3 上游引物 3′-CCAGATCATTGACAA-5′，下游引物 3′-CGCAGTCTCCACTT-5′；FXR 上游引物 3′-CAAAATGACTCAGGAG-5′，下游引物 3′-GCCTCTCTGTCCTTGATGT-5′；SHP 上游引物 3′-TCTCTTCTTCCGCCCT-5′，下游引物 3′-AAGGGCTTGCTGGAC-5′；BSEP 上游引物 3′-AAGCTACATCTGCCTTAG-5′，下游引物 3′-CAATACAGGTCCGACCCTCTCT-5′。

1.2.5 血清膽汁酸含量測定 移取20μl小鼠外周血清樣本，加入180μl膽汁酸氘代內標的預冷乙腈甲醇的混合溶液進行膽汁酸的提取，采用Waters超高效液相色譜串聯質譜聯用儀檢測鵝去氧膽酸（CDCA）、去氧膽酸（DCA）、牛磺 β 鼠膽酸（TβMCA）、甘氨膽酸（GCA）、膽酸（CA）、牛磺膽酸（TCA）、牛磺鵝去氧膽酸（TCDCA）、牛磺石膽酸（TLCA）、石膽酸（LCA）等膽汁酸及總膽汁酸（Totol BA）定量的絕對濃度。

1.2.6 肝組織病理學觀察 分離肝臟，觀察肝臟大體，固定、脫水、石蠟包埋，HE染色后于光學顯微鏡下觀察小鼠肝臟病理改變，參照美國國立衛生研究院NAFLD臨床研究網病理工作組指南，進行NAFLD活動度積分（NAS）評分[9]，見表1；制作冰凍切片，油紅O染色后觀察肝臟脂滴含量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠體重、肝指數及生化指標的比較 在實驗過程中，STZ+HFHC+RSV組死亡2只，STZ+HFHC組死亡1只，STZ+普通飼料組無死亡，故每組各選取8只小鼠進行檢測比較。STZ+HFHC組肝指數、AST、HDL、LDL和TC較STZ+普通飼料組均明顯升高（均P＜0.05）；STZ+HFHC+RSV 組肝指數、FPG、ALT、AST、HDL、LDL、TC 和TG較STZ+HFHC組均明顯下降（均P＜0.05），見表2。

表1 NAS評分標準

2.2 3 組小鼠肝組織 TNF-α、MCP-1、Collagen Type I、TGF-β和GPC3 mRNA表達水平的比較 STZ+HFHC組 TNF-α、MCP-1、Collagen Type I、TGF-β 和 GPC3 mRNA表達較STZ+普通飼料組均明顯增加（均P＜0.05）；STZ+HFHC+RSV 組 MCP-1、Collagen Type I、TGF-β和GPC3 mRNA表達水平較STZ+HFHC組均明顯下降（均 P＜0.05），見表 3。

2.3 3組小鼠血清膽汁酸含量的比較 選取STZ+HFHC+RSV組5只，STZ+HFHC組6只，STZ+普通飼料組5只小鼠進行血清膽汁酸含量的檢測。與STZ+普通飼料組比較，STZ+HFHC 組 Totol BA 、CDCA、DCA、TβMCA 均明顯升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與STZ+HFHC 組比較，STZ+HFHC+RSV 組 Totol BA、CDCA、DCA、TβMCA、GCA、CA、TCA、TCDCA、TLCA 均明顯降低，且差異有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表2 3組小鼠體重、肝指數及生化指標的比較

表3 3組小鼠肝組織TNF-α、MCP-1、Collagen Type I、TGF-β和GPC3 mRNA表達水平的比較

表4 3組小鼠血清膽汁酸含量的比較（ng/L）

2.4 3組小鼠肝組織膽汁酸受體及下游靶基因FXR、SHP和BSEP mRNA表達水平的比較 STZ+HFHC組FXR mRNA表達水平較STZ+普通飼料組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；STZ+HFHC+RSV組FXR、SHP和BSEP mRNA表達水平較STZ+HFHC組均明顯上升（均 P＜0.01）；并且 STZ+HFHC+RSV組 FXR較STZ+普通飼料組有顯著升高（P＜0.01），見表5。

表5 3組肝組織FXR、SHP和BSEP mRNA表達水平的比較

2.5 3組小鼠肝組織病理變化 肝臟外觀：STZ+普通飼料組小鼠肝臟顏色暗紅，質地柔軟，表面光滑無贅生物；STZ+HFHC組出現腫瘤結節的肝臟顏色暗紅，體積較STZ+普通飼料組稍微偏大，部分呈黃色，質韌，表面出現白色顆粒狀物；STZ+HFHC+RSV組較STZ+普通飼料組肝臟顏色略黃、體積較大，質地介于STZ+普通飼料組和STZ+HFHC組之間，肝臟表面有少量白色顆粒狀物，均未出現腫瘤結節。HE染色：STZ+普通飼料組肝細胞形態正常；STZ+HFHC組細胞體積增大，出現了竇周纖維化、核異常、異型增生結節及早期肝癌，脂肪變、小葉內炎癥及NAS評分較STZ+普通飼料組明顯升高（P＜0.05）；STZ+HFHC+RSV組肝小葉結構完整，未見核異常、異型增生結節和肝癌，脂肪變、NAS評分較STZ+HFHC組明顯下降（P＜0.05）。油紅O染色：油紅O染色顯示STZ+普通飼料組小鼠肝臟無染色，STZ+HFHC組染色陽性，STZ+HFHC+RSV組染色面積、強度較STZ+HFHC組減輕，見圖1（插頁）及表6。

表6 3組肝組織脂肪變、小葉炎癥、氣球樣變及NAS評分的比較

3 討論

筆者采用HFHC聯合STZ誘導C57BL/6J雄性小鼠，肝臟病理形態出現了脂肪變（NAFL）、炎癥（NASH）、纖維化（fibrosis）及腫瘤（HCC），提示 NASH-HCC 造模成功。與有關報道中的NASH-HCC實驗動物模型[10]比較成功率更高，造模時間更短，并且進一步證實了NASH-HCC是遺傳與環境共同作用的結果。RSV廣泛存在于中草藥（如虎杖等）及食用植物（花生、葡萄等）中，具有多種藥理活性，在改善糖尿病、脂肪肝等代謝綜合征領域以及肝纖維化、肝癌等方面發揮重要作用。第三軍醫大學軍事預防醫學院營養與食品安全研究中心人員研究發現RSV可通過上調高脂喂養大鼠肝內pAMPK與SIRT1和下調SREBP-1c表達與轉錄活性，從而預防NASH的發生[11]。Nishikawa等[4]報道RSV能改善高脂飲食誘導的NASH小鼠肝臟脂肪變，降低老年小鼠肝臟中前炎癥因子IL-1β、IL-6及 TNF-α水平。Kessoku等[12]研究發現RSV能減輕NASH小鼠炎癥和纖維化。RSV還具有抗腫瘤作用，能通過阻滯多種前炎癥反應信號通路的分子表達，降低細胞COX-2活性和前列腺素R產生，抑制iNOS表達和活性，從而發揮抗腫瘤作用[13]。由此可以看出RSV對NASH-HCC進程中的起始、促進及發展階段都有明顯抑制作用。本研究結果顯示，RSV能夠顯著改善模型小鼠肝癌早期脂肪變、炎癥及纖維化，降低血糖、TG、肝指數，改善肝功能，減少HCC發病率。

目前，越來越多的研究證實膽汁酸在調控脂肪、糖、能量等代謝性疾病及腫瘤中扮演著重要的角色。研究發現 GCA、TCA、GCDCA、TCDCA、GDCA、DCA 和 TDCA均與胃腸道腫瘤密切相關[14]。Ferslew等[15]發現NASH患者血清總膽汁酸/結合膽汁酸比值呈顯著上升趨勢。肥胖和糖尿病人中多數可以檢測到異常升高的膽汁酸，尤其是疏水性次級膽汁酸如DCA和LCA。TβMCA在一定程度上可以誘導肥胖和肝脂肪變性，并且影響葡萄糖和胰島素耐受性，以及與之有關的肝腫瘤[16]。疏水性次級膽汁酸可以引起細胞的氧化應激反應，導致DNA損傷，線粒體功能紊亂、細胞膜完整性破壞，最終致肝細胞癌變[17]。TLCA可損害膽汁酸流出通道導致膽汁淤積癥[18]。TCA下調葡萄糖異生基因的表達，誘導肝細胞炎性因子的產生[19]。CDCA可以誘導Snail基因的表達，抑制E-鈣粘蛋白的表達，從而促進肝腫瘤轉移和浸潤。用DCA處理DEN的小鼠模型中發現DCA具有強烈的促進肝腫瘤形成的作用。TCDCA、GCDCA、GCA和DCA具有明顯細胞毒作用，可以引起正常肝細胞DNA損傷和細胞死亡[20]。DCA和CDCA可通過溶解細胞膜造成肝組織損傷，從而誘導肝癌發生[21]。有文獻報道DCA、TDCA、GCA、TCDCA、TCA、TLCA 及總膽汁酸在肝內積累增加肝臟毒性，導致NASH-HCC的發生發展，并在體外采用人肝癌細胞HepG2經過油酸和高糖處理細胞模擬高脂高糖環境，予以DCA、CA、TCDCA等進行干預，發現 HepG2腫瘤細胞大量增殖，DCA、LCA、CA和TCDCA增加了癌基因c-myc蛋白表達，TCDCA則明顯抑制了抑癌基因CEBPα的表達，這一結果充分證實高脂可以誘導多種肝細胞毒性膽汁酸成分在肝內淤積導致肝細胞損傷，從而促進肝癌的形成[22]。本研究結果顯示RSV干預NASH-HCC小鼠后多種致癌膽汁酸DCA、GCA、TCA、TβMCA、TCDCA、CDCA、CA、TLCA 及總膽汁酸水平顯著下降，肝損傷明顯減少，肝臟炎性因子和腫瘤因子水平也得到明顯改善，HCC發病率降低。

內源性膽汁酸的代謝自穩依賴于其作用的受體，其中FXR在膽汁酸的合成、分泌和重吸收方面具有極為關鍵的作用[23]。Guo等[24]發現FXR在預防HCC中具有重要作用。敲除FXR15個月的C57小鼠會自發形成肝癌，而且并發嚴重的膽汁淤積現象，說明FXR缺失可能是誘導肝臟慢性疾病以及肝癌發生的重要原因之一。SHP是FXR最主要的下游基因。膽汁酸合成的負反饋調節是通過膽汁酸受體FXR和SHP的級聯行動調控完成的[25]。肝細胞膜上BSEP是肝臟中主要承擔膽汁酸分泌和排泄的轉運體蛋白，是FXR主要的靶基因。BSEP正常表達和功能發揮對于膽汁酸的肝臟排泄至關重要。SHP也參與BSEP調節。當肝細胞內膽汁酸過高，激活FXR，FXR通過誘導SHP表達的增加，與BSEP啟動子近端的IR-1（反向重復的AGGTTCA六聚體）元件結合，誘導BSEP表達，促進膽汁酸流出肝臟，使肝細胞避免膽汁酸超負荷所引發的組織損傷[26]，如果FXR/SHP受到抑制，不能誘導BSEP正常表達，則導致膽汁酸在肝內的累積增加肝細胞毒性。

膽汁酸能夠直接結合在FXR上抑制或促進其轉錄活性，進而促進或抑制炎癥及腫瘤的進展[27]。Jiang等[28]研究發現增加TCA水平能顯著抑制FXR受體。另有多項研究發現游離膽汁酸CDCA、DCA及CA可以增加FXR表達，結合膽汁酸GCA和TCA則可以下調FXR的表達。TβMCA是一種內源性的FXR受體強力拮抗劑，能夠顯著抑制FXR表達。另一方面，升高的膽汁酸刺激Kupffer細胞引起促炎細胞因子水平升高，激活的NF-κB抑制了肝內FXR受體[29]。本實驗結果顯示STZ+HFHC組FXR、SHP和BSEP mRNA表達下降，可能是結合膽汁酸與游離膽汁酸的效應平衡被打破，結合膽汁酸對FXR表達抑制效應顯著，游離膽汁酸對促進FXR表達效應較弱，使FXR受體抑制，從而不能維持肝內膽汁酸穩態平衡，FXR下調使得靶基因SHP和BSEP表達下降，導致具有細胞毒性的膽汁酸不能有效排泄，引起膽汁酸的肝內堆積，從而導致正常肝細胞損傷，促進腫瘤形成。通過RSV干預降低了膽汁酸組分，使得膽汁酸受體FXR及下游靶基因SHP和BSEP水平升高，促進肝內膽汁酸正常排泄，減少膽汁酸淤積對肝細胞的損傷從而降低腫瘤發生率。

綜上，筆者通過動物體內實驗證實RSV可通過調控膽汁酸代謝譜，激活膽汁酸受體，促進膽汁酸在肝內的排泄，進而減少NASH-HCC發生，RSV有望成為治療NASH相關HCC的有效手段。

圖1 3組小鼠肝組織外觀及病理學檢查所見（×100）