吡非尼酮對L-精氨酸誘導的急性胰腺炎小鼠的治療作用研究

史曉賢 李高文

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是一種胰腺的炎癥性疾病，臨床表現為急性上腹痛、惡心、嘔吐、發熱等，嚴重者可伴有胰腺出血壞死、感染、休克等全身并發癥，發病率和病死率逐年升高[1]。AP的病因學和病理生理學尚不明確，因而也缺乏有效的治療策略，細胞因子和炎性介質在AP發病中起重要作用，其中白細胞介素（IL）升高和核因子-κβ（NF-κβ）激活被認為是 AP 發展的關鍵事件[2]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種合成的吡啶酮衍生物，可抑制多種炎性因子合成與分泌、減少脂質過氧化，具有抗炎、抗氧化和抗纖維化作用[3]。本研究采用L-精氨酸誘導AP小鼠模型，觀察PFD對AP小鼠氧化應激、炎癥和細胞凋亡的影響，探討其可能的治療作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠32只，體重20～25g，鼠齡4～6周，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0006]；小鼠在標準實驗室條件下自由飲水和標準飲食，自適應飼養1周。

1.2 主要試劑和儀器 L-精氨酸粉末（25g，批號：1725413）、羧甲基纖維素（CMC，批號：419338）均購自美國 Sigma Aldrich公司，PFD粉劑（批號：53179-13-8）購自美國 Selleck公司，核因子-κβ（NF-κβ）p65 多克隆抗體（ab16502）、辣根過氧化物酶標記的二抗（ab205718）均購自英國Abcam公司，ApopTag過氧化物酶原位凋亡檢測試劑盒購自美國Millipore公司，二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（2016206）、蘇木素-伊紅（HE）染液（2016006）、RIPA 裂解液（2016062）、SDS-PAGE 電泳緩沖液（2016070）、聚偏氟乙烯（PVDF）和增強化學發光（ECL）檢測試劑盒（2016028）均購自南京建成生物工程研究所，髓過氧化物酶（MPO）抗體（A0398）購自丹麥Dako公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（23227）購自美國Thermo公司，4-羥基壬烯醛（4-HNE）抗體（198960）、GAPDH（AF5718）均購自美國 R&D Systems公司，全自動生化分析儀（日立7600-020）購自日本Hitachi公司，光學顯微鏡（Olympus BX-50）購自日本Olympus公司。

1.3 藥物制備 將L-精氨酸粉末溶解在0.9%氯化鈉溶液中，濃度為20%，并調節pH至7。PFD粉劑懸浮在0.5%的羧甲基纖維素（CMC）中。

1.4 實驗分組及樣品收集 將32只小鼠按隨機數字表法隨機分為對照組、模型組、PFD低和高劑量組4組，每組8只。造模前禁食12h，不禁水。模型組、PFD低和高劑量組小鼠腹腔注射L-精氨酸溶液（4g/kg）2次（間隔1h）誘導AP模型[4]，對照組以等體積0.9%氯化鈉溶液代替。PFD低和高劑量組小鼠在造模后1、3、6h分別給予200、300mg/kg的PFD溶液灌胃[5]，對照組和模型組灌胃高劑量組等體積的CMC溶液。

小鼠造模24h后使用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，并通過頸脫法處死。迅速移除胰腺并與周圍的淋巴結和脂肪分離。將胰腺組織樣品分成2份，第1部分固定在10%甲醛溶液中，用于NF-κβ、MPO和細胞凋亡的組織學評估和免疫組織化學研究。將第2部分置于液氮中并儲存在-80℃直至采用Western blot法進一步檢測4-HNE的表達水平。通過心臟穿刺獲得血液樣品并使其在25℃下凝結30 min，在4℃下3 000r/min離心10min，獲得血清樣品并儲存在-80℃直至淀粉酶分析。采用全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶水平。

1.5 胰腺病理檢查 將10%甲醛溶液固定的胰腺組織樣品，行石蠟包埋、切片（4μm）、HE染色后采用光學顯微鏡觀察組織學改變。根據Spormann等[6]的評定標準評定AP的嚴重程度，基于水腫（1、2和3分）、炎細胞浸潤（1、2和 3分）、脂肪壞死（3、5和 7分）和實質壞死（3、5和7分）4個組織學表現情況進行評分，總分20分，評分越高AP越嚴重。

1.6 凋亡腺泡細胞百分比測定 使用ApopTag過氧化物酶原位凋亡檢測試劑盒通過末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）方法測定凋亡腺泡細胞的百分比。同時采用Image 6.0軟件計算TUNEL陽性細胞數（以細胞核深褐色為定義），并以陽性細胞百分比（陽性細胞數/細胞總數）表示。

1.7 NF-κβ因子表達測定 采用免疫組織化學法。胰腺組織樣品固定在10%甲醛溶液中24h后，石蠟包埋，切成4μm的厚度，二甲苯和乙醇脫羧10min，檸檬酸緩沖液pH 6.0在微波中13min以提取抗原，與3%過氧化氫（H2O2）一起溫育5min以阻斷內源性過氧化物酶活性，并滴加3%正常馬血清20min以阻斷非特異性結合，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌，滴加NF-κβ p65多克隆抗體（1∶150）在 4℃溫育過夜，用 PBS洗滌，與辣根過氧化物酶標記的二抗一起溫育30min。DAB顯色，HE復染。在光學顯微鏡下，陽性細胞是具有深褐色染色細胞核的胰腺腺泡細胞。通過Image 6.0軟件于40×放大倍數下在10個隨機選擇的視野中計數陽性染色細胞的平均數目，并表示為陽性細胞的百分比（陽性細胞數/細胞總數）。

1.8 MPO陽性細胞數測定 采用免疫組織化學法。福爾馬林固定、石蠟包埋、4μm切片、梯度乙醇水化，使用EDTA抗原修復緩沖液（pH 8.0）在微波中進行抗原修復13min。自然冷卻后，將組織置于pH 7.4的PBS中洗滌2次，每次5min，將組織與3%H2O2溶液在室溫下在黑暗中溫育 25min，滴加一抗 MPO 抗體（1∶500）在 4℃下溫育過夜。將組織在抗山羊二抗（1∶1 000）中25℃溫育30min，HE染色。在光學顯微鏡下，陽性細胞為具有深棕色核的細胞。于40×放大倍數下，在10個隨機選擇的視野中計數MPO陽性細胞的數量，結果表示為每個高倍鏡視野（HPF）的陽性染色細胞的平均數。

1.9 4-HNE檢測 采用Western blot法。按照說明書上的方法，用RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測胰腺勻漿中的蛋白質濃度。行SDSPAGE電泳，并轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗 4-HNE（1∶500）、GAPDH（1∶500）4℃下溫育過夜。然后加入過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG（1∶800）溫育1h，采用ECL進行化學發光檢測。Image 6.0軟件測定灰度值，GAPDH作為內參。

1.10 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠血清淀粉酶水平的比較 模型組血清淀粉酶水平（3 938.50±771.55）U/L明顯高于對照組（880.35±161.98）U/L，差異有統計學意義（P＜0.05），而PFD低劑量組淀粉酶水平（3 012.62±486.85）U/L和高劑量組（2 869.31±255.73）U/L均低于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），PFD低劑量和高劑量組淀粉酶水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 4組小鼠胰腺組織病理狀況的比較 胰腺組織病理狀況見圖1（插頁），對照組部分大鼠胰腺有很輕微的水腫，偶見少量炎細胞浸潤，無出血壞死。與對照組相比，模型組大鼠胰腺組織呈廣泛凝固性壞死，可見炎性細胞浸潤，間質明顯水腫，胰腺水腫、炎癥浸潤、脂肪壞死、實質壞死評分均明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，PFD低劑量和高劑量組胰腺組織壞死、炎性細胞浸潤、脂肪壞死和實質壞死程度均減輕，胰腺水腫、炎癥浸潤、脂肪壞死、實質壞死評分均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 4組小鼠凋亡腺泡細胞百分比的比較 4組大鼠TUNEL染色的代表性圖像見圖2（插頁），凋亡腺泡細胞呈深棕色。模型組凋亡腺泡細胞百分比（2.72±2.64）%明顯高于對照組（0.50±0.46）%，差異有統計學意義（P＜0.05），PFD低劑量（0.46±0.13）%和高劑量組（0.37±0.08）%則均明顯低于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 4組小鼠胰腺組織病理學評分的比較

2.4 4組小鼠NF-κβ因子表達和MPO陽性細胞數的比較 模型組NF-κβ陽性細胞百分比（47.95±12.98）%明顯高于對照組（6.27±2.31）%，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組的NF-κβ陽性細胞百分比比較，PFD低劑量組（3.63±1.61）%和高劑量組（11.68±6.44）%均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖3（插頁）。與對照組（0.13±0.35）個/HPF相比，模型組MPO陽性細胞的數量（29.57±3.18）個/HPF明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，PFD低劑量（1.25±0.67）個/HPF和高劑量組MPO陽性細胞的數量（0.75±0.40）個/HPF均明顯減少，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖 4（插頁）。

2.5 4組小鼠4-HNE表達的比較 模型組4-HNE蛋白表達明顯高于對照組，而低劑量PFD組和高劑量PFD組4-HNE表達低于模型組（P＜0.05），但與對照組非常相似（圖 5、表 2）。

圖5 4組小鼠4-HNE蛋白表達的電泳圖

表2 4組小鼠4-HNE蛋白相對表達水平的比較

3 討論

血淀粉酶升高常被用作胰腺炎診斷的條件，本研究發現L-精氨酸可以誘導AP，這可以通過血清淀粉酶升高和胰腺組織病理學變化來證明，而低劑量和高劑量的PFD處理使血清淀粉酶降低，且小鼠中胰腺組織病理損傷有所恢復。

中性粒細胞是AP中急性炎癥發展的重要參與者，通過釋放MPO、蛋白酶和活性氧（ROS）來發揮作用[7]。在本研究中，通過測量胰腺組織中的MPO陽性來確定中性粒細胞活性。結果表明，與對照組相比，AP小鼠的MPO陽性細胞數明顯增加，但經PFD治療后，MPO陽性細胞數量恢復正常。與此一致，盡管沒有直接在AP中進行研究，但在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠經PFD治療后中性粒細胞水平顯著降低[8]。

NF-κβ因子激活是AP發展的關鍵事件，NF-κβ導致炎癥細胞因子及種趨化因子的產生，如TNF-α、IL-6和IL-8[9]。研究表明NF-κβ活性與AP的嚴重程度增加相關[10]。在本研究中，筆者發現在AP小鼠中NF-κβ表達增加，而低劑量和高劑量PFD治療均使其減弱，組織病理學上NF-κβ表達的變化與胰腺炎的嚴重程度相關。先前的研究表明PFD通過抑制NF-κβ的激活對急性肝炎小鼠起到有效的肝保護作用[5]。

氧化應激是胰腺腺泡細胞損傷后引起炎癥反應加速和多器官功能障礙的主要事件之一[11]。多不飽和脂肪酸的脂質過氧化是氧化應激的結果，產生4-HNE，可作為氧化應激的標志物。在本研究中，模型組小鼠的4-HNE表達較對照組幾乎增加了一倍，而兩種劑量的PFD均可降低4-HNE表達的活性，這個現象表明了氧化應激的改善。在肝硬化和肝炎的研究中，PFD治療減輕氧化負擔[5]。上述證據表明PFD具有抗氧化作用，可用于治療包括AP在內的多種炎癥。此外，4-HNE等脂質過氧化產物通過誘導Fas表達、p53的誘導、磷酸化和核轉位以及隨后的caspase3活化而參與細胞凋亡的發展[12]。胰腺腺泡細胞凋亡是AP細胞死亡的主要原因，L-精氨酸誘導的AP與腺泡細胞的凋亡有關[13]。本實驗結果證實了先前觀察結果的發現，即L-精氨酸誘導的AP小鼠的腺泡細胞凋亡程度顯著高于對照組小鼠中觀察到的程度，在低和高劑量PFD處理中，凋亡腺泡細胞下降至對照組小鼠水平。

綜上所述，PFD低、高劑量均可減輕L-精氨酸誘導的AP小鼠的炎癥、氧化應激和腺泡細胞凋亡，從而減輕胰腺組織病理學改變。

圖1 4 組小鼠胰腺組織病理學的 HE 染色結果比較（箭頭表示炎癥、水腫和脂肪壞死，×40）

圖2 4組小鼠TUNEL分析腺泡細胞凋亡情況比較（箭頭表示凋亡的腺泡細胞，×40）

圖3 4組小鼠胰腺中NF-κβ因子表達的免疫組化分析比較（箭頭表示NF-κβ陽性細胞，×40）

圖4 4組小鼠胰腺中MPO陽性細胞免疫組化分析比較（箭頭表示MPO陽性細胞，×40）