CRISPR/Cas9慢病毒系統敲除胰島β細胞PKA C-α的研究

何士俊 萬毅虹 章嘉雯 蔡秀潮 劉靜文 劉叔文 姚新剛

（廣東省新藥篩選重點實驗室 南方醫科大學藥學院，廣州 510515）

蛋白激酶 A［1］（Protein Kinase A，PKA）又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A，是一種結構最簡單、生化特性清楚的蛋白激酶［2］。在大多數哺乳類細胞中，一類蛋白激酶A存在于胞質溶膠，另一類結合在質膜、核膜和微管上［3-4］。在胰島β細胞中，PKA具有促進胰島素分泌的作用［5-7］。研究表明，GLP-1與其受體結合［8］，激活胰升糖素樣肽-1受體-環腺苷二磷酸-蛋白激酶A（GLP-1R-cAMP-PKA）通路［9］，促使腺苷酸環化酶活化，升高胰腺β細胞內cAMP濃度，激活PKA使葡萄糖信號轉導途徑中一些起關鍵作用的蛋白質磷酸化而促使胰島素分泌［10］，包括對ATP敏感的鉀離子通道Sur1［11］，電壓依賴性的鈣離子通道VDCC［12］，以及與胰島素釋放機制相關的分子，增加抗凋亡蛋白水平［13］；同時PKA還可激活cAMP反應元件結合蛋白（CREB）［14］和胰十二指腸同源盒基因（PDX-1），繼而與CREB基因啟動子區的一個關鍵性的DNA序列結合［15］，從而加強胰島素原基因轉錄的效率，增加胰島素的轉錄及合成［16］。但是PKA在促進胰島β細胞分泌胰島素中究竟發揮著多大的作用以及是否還有除PKA以外的作用途徑仍不清楚；前期研究主要通過siRNA干擾［17］和采用抑制劑［18］等手段研究PKA在胰島β細胞中的作用，這些手段并沒有完全敲除胰島β細胞中的PKA，其瞬時性和不徹底性的弊端會影響對基因功能的正確判斷。因此，本研究采用CRISPR/Cas9技術定點敲除INS-1細胞中PKA C-α基因，得到穩定敲除PKA C-α基因的細胞株，以期對PKA在胰島β細胞的作用進行更深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠胰島瘤INS-1細胞、293T細胞、Stbl3感受態細胞，蛋白上樣緩沖液（實驗室保存）；lentiCRISPRv2（98290）、pCMV-VSV-G（8454）、psPAX2（12260）質粒購自 Addgene公司；polyjet轉染試劑（SL100688）購自SignaGen生物技術公司；polybrene（TR-1003-G） 購 自 EMD Millipore公司；RPMI1640培養基（11875093）、DMEM培養基（10566016）、澳洲胎牛血清（10099141）、限制性內切酶BsmB I（FD0454）、FastAP去磷酸化酶（EF0654）、DTT（707265ML）、ECL化學發光液（RJ236892）、青霉素和鏈霉素（15140122）購自Thermoscientific公司；T4 PNK激酶（M0201S）、快速連接酶（M2200S）購自NEB公司；RIPA裂解液（P0013B）購自碧云天公司；質粒小提試劑盒（AP-MN-P-50）購自Axygen公司；膠回收試劑盒（28704）購自Aiagen公司；細胞基因組DNA提取試劑盒（D3396）購自Omega公司；嘌呤霉素（AAJ67236-8EQ）購自VWR 公司；PKA C-α抗體（D38C6）、β-actin抗體（D6A8）、辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔IgG（7074s）購自Cell Signaling Technology公司；2×HieffTMPCR Master Mix（10102ES03）購自上海翊圣生物科技有限公司；Insulin High Range Kit 500 tests（62IN1PEG）購自Cisbio公司；小向導RNA（sgRNA）序列合成及質粒測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 293T細胞培養于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基；INS-1細胞培養于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素、5.6mmol/L葡萄糖、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉、0.5 mmol/L b-巰基乙醇的RPMI 1640培養基，在37℃、5% CO2條件的細胞培養箱中培養。

轉染前24 h，293T細胞鋪6孔板，細胞密度為1×105cell/mL，轉染前0.5 h用新鮮培養基換液。1 μg DNA（500 ng sgRNAlentiCRISPR質 粒、250 ng psPAX2質粒、250 ng pCMV-VSV-G質粒）混于50 μL無血清無雙抗培養基，3 μL PolyJet轉染試劑也溶于無血清無雙抗培養基，孵育10 min，將PolyJet混合物加入DNA混合物，室溫孵育10 min后加入6孔板中，24 h后更換培養基。

1.2.2 sgRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈合成 應用http：//crispr-mit.edu/網站設計所需的目的基因sgRNA片段，設計時正義鏈模板的5'添加CACC，與BsmB I酶切后形成的黏性末端互補；反義鏈模板的5'端添加AAAC，與BsmB I酶切后形成的黏性末端互補，參考大鼠的基因組，對PKA C-α（Gene ID ：25636https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_005118.4?report=genbank&from=25095089&to=25118869）的10個外顯子序列進行引物設計打分（https：//zlab.bio/guide-design-resources），選出2條分數最高的sgRNA序列分別如下：

所有寡核苷酸鏈和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成

1.2.3 lentiCRISPRv2-sgRNA質粒的重組構建 用BsmB I限制性內切酶線性化lentiCRISPRv2質粒，酶切體系如下：lentiCRISPRv2，5 mg；FastDigestBsmB I，3 μL ；FastAP，3 μL ；10× FastDigest Buffer，6 μL；100 mmol/L DTT（ 新 鮮 配 制 ），0.6μL；加水至60 μL；37℃中反應30 min完成后進行切膠回收。將sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，體系如下：Primer 1（100 μmol/L），1 μL；Primer 2（100 μmol/L），1 μL ；10× T4 Ligation Buffer，1 μL ；T4 PNK 激酶，0.5 μL；加水至 10 μL，37℃，30 min；95℃，5 min；95℃以5℃/min降至25℃；4℃保存，將退火引物用滅菌水按1∶200稀釋。連接體系：線性化質粒lentiCRISPRv2，50 ng；稀釋的退火引物，1 μL ；2×Quick Ligase Buffer，5 μL ；快速連接酶，1 μL；加水至11 μL，25℃鏈接 10 min。將連接得到的11 μL體系全部轉化到Stbl3感受態中，挑取單克隆進行小搖，再進行小提質粒并測序驗證。

1.2.4 慢病毒制備與感染 將293T細胞鋪6孔板，待細胞密度生長至60%-80%。將構建好的sgRNA-lentiCRISPRv2質粒和慢病毒包裝輔助載體psPAX2、pCMV-VSV-G質粒按照sgRNAlentiCRISPR∶psPAX-2∶pCMV-VSV-G為2∶1∶1的比例混合，將混合好的慢病毒表達系統轉入293T細胞內，24 h后更換培養基，換成DMEM∶RPMI 1640為1∶1的培養基，換液24 h后收集細胞上清液即為慢病毒原液。感染前將INS-1細胞按2×105cell/well鋪于12孔板中，24 h后細胞將近有80%密度，將病毒上清液按100mL/well加入INS-1細胞中，促感染劑polybrene以1∶1 000的比例加入，充分混勻。6 h后換液，繼續培養。

1.2.5 敲除PKA C-α基因的INS-1細胞株的初篩選與驗證 sgRNAlentiCRISPR-Cas9慢病毒侵染INS-1細胞48 h后，更換為含1 μg/mL嘌呤霉素的RPMI1640培養基培養，待12孔板中對照孔的INS-1細胞全部死亡后，將其他孔的細胞轉移至6孔板，待6孔板長滿時一部分轉移至25 cm3細胞皿中接著培養，另一部分則加入RIPA裂解液提取蛋白，加入蛋白上樣緩沖液并于沸水浴中反應10 min，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳（80 V，20 min跑濃縮膠；120 V，1.5 h跑分離膠）；再采用濕轉法以100 V，1 h的條件轉移至PVDF膜；以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；內源性PKA C-α抗體4℃ 過夜孵育，TBST洗膜3次，每次10 min；HRP偶聯的羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜6次，每次5 min；ECL化學發光液進行顯影、曝光。

1.2.6 敲除PKA C-α基因的INS-1單克隆細胞的挑選與測序鑒定 由Western blotting印記驗證有敲低效果的INS-1細胞按5 cell/mL的密度鋪到96孔板中，待24 h細胞貼壁后在顯微鏡下找出只有單個INS-1細胞的孔，繼續擴大培養，在96孔板長滿時（一般5-6周左右），轉移至12孔板繼續培養，待12孔板長滿后，一部分轉移至25 cm3細胞皿中接著培養，另一部分提蛋白驗證是否有敲除效果。將有敲除效果的INS-1細胞用Tissue DNA Kit D3396試劑盒提取細胞DNA，再經過PCR擴增（PKA C-α基因PCR擴增引物為：Forward primer：CTCTCCCTGCTCCCAGAGAA，Reverse primer：ATGAGTCCAAGGCCAGCTTC）， 擴增體系為：模板DNA，適量；Forward primer（10 μmol/L），2 μL ；Reverse primer（10 μmol/L），2 μL ；2×HieffTM PCR Master Mix，25 μL ；加水至 50 μL，94℃，5 min，1個循環；94℃，30 sec，35個循環；60℃，30 sec，35個循環；72℃，30 sec/kb，35個循環；72℃，10 min，1個循環。PCR擴增完成后的產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行T載體克隆，測序結果與PKA C-α基因進行比對。

1.2.7 葡萄糖刺激胰島素分泌實驗 （GSIS）將INS-1細胞接種在24孔板中并在5% CO2、37℃中孵育48 h，待INS-1細胞密度達到80%-90%時，將細胞與含有0.2% BSA的Krebs-Ringer Bicarbonate HEPES buffer（KRB 緩 沖 液：115 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，24 mmol/L NaHCO3，2.5 mmol/L CaCl2和10 mmol/L HEPES）預孵育2h，然后以低糖（2.8 mmol/L葡萄糖）或高糖（16.8 mmol/L葡萄糖）刺激INS-1細胞2 h（葡萄糖配在含有0.2% BSA的KRB緩沖液中），最后收集細胞上清液以測定胰島素分泌。使用胰島素試劑盒Insulin High Range Kit 500 tests測量胰島素濃度。

1.2.8 統計分析 使用Graph Pad Prims5軟件的One-Way Anova分析統計學顯著性。數值表示為*P＜0.05，**P＜0.01，和 ***P＜0.001。如果沒有另外說明，誤差條代表平均值的SD。

2 結果

2.1 sgRNA靶點以及寡核苷酸序列設計

lentiCRISPRv2質粒信息見圖1-A；本研究針對PKA C-α基因的兩個外顯子Exon 5和Exon 7設計sgRNA序列，分別為sgRNA2和sgRNA1，其插入位置和序列信息見圖1-B。sgRNA靶點以及寡核苷酸序列見表1。

圖1 靶向PKA C-α基因的sgRNA的設計

表1 PKA C-α-sgRNA寡核苷酸序列

2.2 LentiCRISPRv2-sgRNA構建質粒的測序結果

針對PKA C-α基因構建重組LentiCRISPRv2-sgRNA質粒，測序結果（圖2）顯示，兩條sgRNA序列均正確插入lentiCRISPRv2，插入序列的位置、方向及序列與預期相符，證明載體構建完全正確。

2.3 敲除PKA C-α基因的INS-1細胞株的初篩選與驗證

用1 μg/mL嘌呤霉素的RPMI1640培養基培養INS-1細胞至對照組細胞全部死亡后（24 h），抽提細胞蛋白進行Western blotting印記驗證，結果（圖3）顯示，PKA C-αsgRNA1基本沒有敲低效果；PKA C-αsgRNA2敲低效果很明顯。對PKA C-αsgRNA2細胞組進行有限稀釋進而篩選出單克隆細胞。

2.4 建立穩定敲除PKA C-α基因的INS-1細胞株

將PKA C-αsgRNA2細胞組按5 cell/mL的密度鋪到96孔板中，挑選出單克隆細胞即為PKA C-α基因敲除的細胞（KO細胞）（大約5-6周），抽提細胞蛋白進行Western blotting印記驗證（圖4-A）；同時提取PKA C-α基因敲除細胞（KO）和野生型細胞（WT）的DNA進行PCR擴增，并采取T克隆測序，測序后與原基因組DNA進行對比（圖4-B），結果（圖4-C）顯示KO細胞發生1bp堿基的插入突變。Western blotting印記驗證結果和T克隆測序結果證實PKA C-α基因敲除成功，穩定敲除PKA C-α基因的INS-1細胞株建立成功。

圖2 LentiCRISPRv2-sgRNA測序圖

圖3 Western blotting印跡初步鑒定

2.5 敲除PKA C-α基因的INS-1細胞胰島素分泌能力檢測

葡萄糖刺激胰島素分泌實驗結果（圖5）顯示，敲除PKA C-α基因的INS-1細胞低糖刺激下，其胰島素的分泌較正常的INS-1細胞少，結果無顯著性差異；但在高糖刺激，其胰島素的分泌較正常的INS-1細胞更少，結果有顯著性差異，說明敲除PKA C-α基因的INS-1細胞胰島素的分泌能力降低。

3 討論

基因編輯技術［19］的飛速發展為基因功能研究工作提供了更多有力的工具，特別是鋅指核酸酶（FZN）［20］、轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN）［21］和最近發展起來的CRISPR技術［22-24］以及基于CRISPR/Cas9基因編輯技術改進的單堿基編輯技術，為基因編輯提供了前所未有的方便和快捷。單堿基編輯技術（Base editor，BE）通過將Cas9切口酶（Cas9 nikase，Cas9n）或無核酸酶活性的Cas9（nuclease dead Cas9，dCas9）與胞嘧啶脫氨酶形成融合蛋白，并通過sgRNA（單鏈向導RNA）將融合蛋白靶向靶位點，在不切割雙鏈DNA的情況下對靶基因位點的單個堿基進行胞嘧啶C→胸腺嘧啶T或鳥嘌呤G→腺嘌呤A的精準編輯，在人細胞系和小鼠細胞系中，這種剪輯編輯器永久性地和高效地將堿基胞嘧啶（C）轉化為堿基尿嘧啶（U），同時具有較低的編輯錯誤發生率［25］。相對于其他基因編輯技術，本實驗選擇CRISPR/Cas9技術，一方面是由于用于基因敲除的CRISPR 載體構建極其簡單，只需要根據推薦的序列合成spacer并將其整合進載體，就完成了基因編輯載體體外的操作過程且其特異性好，可以實現多基因編輯［26］；另一方面，本實驗采用的慢病毒［27］侵染效率極高，幾乎能感染所有組織來源的細胞［28］；其次，慢病毒載體顆粒在細胞內保持高度的穩定性，維持細胞內病毒量，增加感染率。憑借著成本低廉，操作方便，效率高等優點，CRISPR/Cas9應用廣泛［29-30］，迅速風靡全球的實驗室，成為了生物科研的有力幫手。

圖4 Western blotting印跡鑒定及DNA測序結果

圖5 PKA C-α基因敲除對INS-1細胞胰島素分泌的影響

糖尿病是我國高發病率的疾病，由于糖尿病產生多種并發癥，目前尚無特效治療藥。其中2型糖尿病發病的主要機制是胰島β細胞分泌功能的異常［31］，胰島素分泌對維持血糖穩態起著重要的作用，是表征胰腺β細胞功能正常的重要指標。因此促進胰島β細胞分泌胰島素對2型糖尿病者控制血糖是有效的，甚至對預防糖尿病的發生也有一定的作用。目前也有許多藥物可以促進INS-1細胞胰島素的分泌［32-34］。前期研究表明PKA具有促進胰島素分泌的作用，但是PKA在促進胰島素分泌的過程中究竟發揮多大的作用仍未清楚。本實驗利用敲除PKA C-α基因來檢測PKA C-α對INS-1細胞胰島素分泌的影響。參考大鼠的基因組，對PKA C-α的10個外顯子序列進行引物設計打分，選擇兩個打分最高的外顯子序列設計引物并構建慢病毒質粒，即 lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 5-sgRNA、lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 7-sgRNA質粒，本實驗目的是構建敲除PKA C-α基因的INS-1細胞株并且研究PKA C-α蛋白對胰島素分泌的影響，故直接采用Western blotting印記法驗證敲除結果，不僅可以縮短實驗周期和節省試劑耗材，而且蛋白水平上的變化更能反應PKA C-α基因的敲除效果，結果具有說服力。實驗結果表明lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 7-sgRNA質粒無敲低效果，可能是由于該sgRNA設計不合理或者脫靶效應的產生等；lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 5-sgRNA質粒敲低效果很明顯，故將該組細胞進行T克隆測序，結果顯示，該組細胞的DNA與野生型INS-1細胞DNA的對比，插入了1bp堿基，這說明sgRNA-Cas9慢病毒入侵INS-1細胞后，sgRNA準確地靶向了PKA C-α基因的5號外顯子，隨后Cas9核酸酶在靶位點產生DNA雙鏈斷裂，INS-1細胞DNA在修復過程中，產生了插入突變，導致PKA C-α基因無法轉錄與翻譯；其次，PKA C-α基因敲除后，INS-1細胞胰島素分泌能力大大下降，提示PKA C-α對于INS-1細胞胰島素分泌發揮著重要的作用；此外，本實驗構建的穩定敲除PKA C-α基因的細胞株，與敲除PKA C-α基因動物模型相比，構建時操作較為簡單，成功率高，成本低，可以很快實現。

4 結論

本實驗采用基因編輯技術CRISPR/Cas9系統成功的敲除了INS-1細胞中的PKA C-α基因，構建了穩定敲除PKA C-α基因的細胞株，為更深入研究PKA在胰島b細胞的功能提供了依據。