基質金屬蛋白酶-11在結腸腺癌中的表達及與微淋巴管密度的相關性

劉愛東，馬 征，龐久玲，劉時飛，閆 豐

(1.華北理工大學附屬醫院 病理科，河北 唐山 063000；2. 唐山職業技術學院 醫學校區，河北 唐山 063000；3.唐山市工人醫院 病理科，河北 唐山 063000)

結腸腺癌的前期病變是腸黏膜的上皮內瘤變，尤其是高級別病變，可以發展為浸潤性的腺癌。腫瘤進展過程中常伴有間質的淋巴管生成[1]，D2-40被認為是標記淋巴管內皮細胞最特異性的蛋白，淋巴管生成因子可以誘導淋巴管內皮細胞的增殖，進而形成淋巴管[2]，形成管腔后為腫瘤播散提供直捷通路。近年學者關注淋巴管生成的影響因素。基質金屬蛋白酶家族(MMPs)不僅與轉移有關，還與淋巴管生成有關。基質金屬蛋白酶-11(MMP-11)是家族中的重要成員[3]。本研究關注MMP-11在結腸腺癌中的表達特征，分析其臨床意義及預后價值，探討其與MLVD的關系。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2014年1月至2014年10月在華北理工大學附屬醫院確診為結腸腺癌的患者58例，患者均行根治術，年齡31～86歲，平均(59.2±15.4)歲。納入標準：①經病理醫師復核切片確診，符合WHO中病理診斷標準；②術前未行針對腫瘤的治療。排除標準：①多原發癌患者；②林奇綜合征；③家屬不同意觀察和隨訪者。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣>4 cm的正常結腸黏膜組織作為對照組。本研究經醫院倫理委員會批準，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，患者或家屬簽署知情同意書。

1.2MMP-11和D2-40檢測 應用免疫組織化學SP法檢測兩組中MMP-11和D2-40的表達，試劑均購自蘇州睿贏生物技術公司。應用DAB染色。操作嚴格按說明書進行，做好質量控制。

1.3MMP-11和MLVD判定 MMP-11陽性部位是細胞質，選擇MMP-11染色較為集中且典型的3個區域(熱點區，400倍)進行觀察，每個視野觀察陽性細胞百分比和著色強度，取平均值。陽性細胞百分比：0%、≤25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%依次評為0、1、2、3、4 分。著色強度：無、淡黃、棕黃、棕褐依次評為 0、1、2、3 分。二者相加，分數范圍為0～7分。以≤3分為陰性，>3分為陽性。D2-40陽性部位是淋巴管內皮細胞的細胞質，陽性著色的單個內皮細胞或內皮細胞簇計為一個陽性MLVD。選擇3個淋巴管分布較集中的區域(熱點區，400倍)進行計數，取平均值。

1.4Western blot方法 對結腸腺癌新鮮組織中VEGF-C的表達應用Western Blot進行檢測。內參應用GAPDH。VEGF-C購自武漢博士德生物工程技術公司。首先提取蛋白，測量蛋白濃度后嚴格按實驗步驟操作，并應用化學發光劑顯影。灰度分析應用Image J V1.47H軟件，以蛋白與GAPDH的比值作為半定量結果進行分析。

1.5統計學方法 應用SPSS 17.0分析，行卡方檢驗、t檢驗、Pearson相關分析及K-M生存分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MMP-11陽性率、MVLD值 兩組中MMP-11表達的陽性率、MVLD值差異有統計學意義。見表1，圖1～2。

2.2MMP-11陽性率和MLVD值在不同臨床病理特征分組中表達 結腸腺癌中MMP-11陽性率、MLVD值與脈管癌栓、淋巴結轉移及浸潤深度相關。而與性別和年齡無明顯相關性。見表2，圖3。

2.3MMP-11和MLVD相關性分析 Pearson相關分析顯示MMP-11和MLVD具有正相關性(r=0.49,P=0.028)。見圖4。

表1 兩組MMP-11陽性率、MVLD值的比較

表2 結腸腺癌MMP-11陽性率和MLVD值在不同臨床特征分組中表達的比較

圖1 MMP-11的表達(IHC SP，×200)a.MMP-11在結腸腺癌中陽性表達；b.MMP-11在正常結腸黏膜組織中陰性表達圖2 腫瘤間質的微淋巴管(箭頭為D2-40陽性的淋巴管，IHC SP，×200倍) 圖3 腫瘤脈管浸潤(HE，×200)

圖4 MMP-11和MLVD的相關性分析

2.4MMP-11與生存時間的關系 本組患者均進行術后5年(60個月)生存時間的隨訪。截止時間為2019年10月31日。其中術后5年時點死亡30例，生存25例，失訪3例(失訪患者計為刪失值)。其中死亡患者術后生存時間為4～60個月。以MMP-11評分為3分為臨界值，并應用K-M生存分析顯示MMP-11的表達與生存時間有關，即MMP-11陽性患者的預后差(χ2=3.80，P=0.038)。見圖5。

圖5 MMP-11的表達與生存時間的關系

2.5觀察組中MMP-11與VEGF-C的相關性分析 應用Western blot檢測觀察組中VEGF-C的表達，表達范圍是0.7～3.6，平均2.3。Pearson相關分析顯示MMP-11與VEGF-C具有正相關性(r=0.54,P=0.011)。見圖6、7。

圖6 MMP-11與VEGF-C的相關性分析

圖7 Western blot檢測腫瘤組織中VEGF-C的表達

3 討 論

MMP-11發現較早，但是應用和研究的相對較少，主要是MMP-11和經典的MMPs的功能不同有關。MMP-11不直接對膠原和基底膜進行降解，而是通過對細胞外基質的水解后形成活性酶發揮作用[4]。MMP-11在上皮源性惡性腫瘤表達升高。MMP-11是一種可分泌的蛋白，腫瘤細胞產生MMP-11后可以釋放到周圍組織及血清中，血清中能檢測到MMP-11的表達，其與組織中的表達具有相似性[5]。Hsin等[6]在口腔鱗癌中觀察MMP-11的表達，發現MMP-11與不同臨床病理特征存在相關性，認為MMP-11是促進腫瘤進展的重要因子，其可能對預測腫瘤的生物學行為和預后有重要價值。MMP-11的表達與乳腺癌的預后有關，其高表達預示著腫瘤呈現高轉移的狀態[7]。MMP-11與MMP-14的作用具有相似性，MMP-14可能是MMP-11的下游因子，MMP-11的部分功能是通過誘導MMP-14分泌實現的，其中包括促進腫瘤細胞增殖、轉移、脈管生成及上皮間質轉化。研究顯示高遷移性腫瘤間質的淋巴管內皮細胞的增殖較為活躍，間質中觀察到較豐富的淋巴管生成，結腸腺癌屬于此類腫瘤。這種新生的淋巴管可以與腫瘤細胞相鄰，對腫瘤細胞淋巴道播散更直接。VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，其與VEGF-D有共同作用，能促進淋巴管內皮細胞的增殖[8-9]。D2-40是目前標記淋巴管內皮細胞最特異性的抗體，新增殖淋巴管內皮細胞呈單細胞性、扁平狀和簇狀，在淋巴液的物理性沖擊作用下，形成管腔，逐漸具有淋巴循環的功能[10]。

本研究基于結腸腺癌術后組織進行MMP-11的檢測，結果客觀，實用性強。結果顯示MMP-11在腫瘤中高表達，與脈管癌栓、淋巴結轉移及浸潤深度相關，提示MMP-11異常表達參與腫瘤的形成和進展。在此過程中伴隨著MLVD的協同變化。MMP-11具有癌基因樣的作用，MMP-11在上皮細胞惡性轉變過程中的意義不明顯，而在腫瘤形成的后期作用較為顯著，即MMP-11高表達是腫瘤形成后的中、晚期事件。Hsin等[11]在腫瘤轉移的研究中發現MMP-11高表達，認為MMP-11的功能與Fak/Src通路的活化有關，MMP-11是腫瘤浸潤和轉移的重要促進因子。結果顯示MMP-11與MLVD、MMP-11與VEGF-C間均具有正相關性，由于VEGF-C具有較強的促進淋巴管生成的作用[12]，因此MMP-11可能是通過VEGF-C介導腫瘤間質淋巴管生成的，這種作用明確出MMP-11對間質微淋巴管形成的調節具有間接性，也有研究認為這種作用與MMP-11對絲氨酸蛋白酶聚集后的集中分解有關[6]。MMP-11對淋巴管生成的調控作用與家族中MMP-2、MMP-14的作用相似。MMP-11可以通過直接磷酸化而使下游的因子活化，如AKT和VEGF，使脈管內皮細胞的增生能力提高，也使腫瘤的侵襲能力更強[13]。MMP-11在作用過程中能調節幾種不同的細胞運動，如病灶黏附性的改變、鳥苷三磷酸酶的活化、轉化生長因子通路激活等[14]。本研究結果顯示MMP-11與腫瘤的生存時間有關，提示MMP-11高表達可能提示結腸腺癌預后差。Nonsrijun等[13]在前列腺腺癌中發現MMP-11過表達患者的預后不良，這與本研究結論一致。但是MMP-11對預后判斷的價值及臨界值的選定尚需要后續研究進行多中心、大樣本及多因素的分析后證實。

總之，結腸腺癌中MMP-11的表達升高，間質中MLVD增高，對病變的發生和進展有重要作用。MMP-11和VEGF-C、MLVD有明顯的正向協同作用。MMP-11可能對判斷腫瘤的預后有一定價值。