西地那非通過上調電壓依賴性鉀通道抗低氧刺激的人肺動脈平滑肌細胞增殖

毛 婷,張京春,王躍秀,喬 羽,劉 蓓,張 珊

(中國中醫科學院1.西苑醫院心血管科、2.心血管病研究所，北京 100091；3.首都醫科大學基礎醫學院生理學教研室，北京 100069)

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)與肺血管重構密切相關，特別是肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖異常導致的肺動脈管壁中膜增厚，管腔狹窄。電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent potassium channels，Kv)活性與肺動脈高壓、肺血管平滑肌細胞增殖所致肺血管重構密切相關[1]。低氧引起PASMCs的氧敏感性Kv通道活性和表達降低，PASMCs過度增殖進而肺血管重構[2,3]。近來，西地那非為一種選擇性的磷酸二酯酶V(phosphodiesterase 5，PDE5)抑制劑被用來治療肺動脈高壓，其機制主要涉及肺動脈高壓時肺血管平滑肌細胞的PDE5表達和活性大大增加，西地那非可通過選擇性抑制PDE5活性，增加PASMCs內的環鳥苷一磷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平，進而激活環鳥甘酸依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)，擴張肺動脈，抑制肺血管平滑肌細胞增殖以改善肺血管重構及肺血流動力學。而西地那非能否通過Kv通道影響低氧刺激的PASMCs增殖尚未見研究報道。慢性低氧抑制Kv通道尤其是Kv1.5通道功能是PASMCs增殖異常的關鍵機制。探索西地那非抗低氧刺激的PASMCs增殖以減輕肺血管重構與Kv1.5通道及PKG的關系是本研究的主要目的。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株及培養基原代人PASMCs、平滑肌細胞基礎培養基(smooth muscle cell basic medium，SMBM)和平滑肌細胞生長補充物(smooth muscle growth supplement，SMGS)均購自美國Cascade Biologics公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于美國Gibcobrl公司。

1.2 試劑及儀器西地那非(純品)購于美國輝瑞公司；PKG抑制劑KT-5823購于德國Merck公司；兔抗人Kv1.5抗體(APC-150)購于以色列Alomone公司；羊抗兔二抗(C50331)購于美國LI-COR公司，兔抗人Ki67抗體(ab15580)購于英國Abcam公司；脂質體2000(Lipo2000)(1168000)購于美國Invitrogen公司；Kv1.5基因的小分子干擾RNA片斷(siRNA)序列如Tab 1所示，劑型為凍干粉，合成于美國ThermoFisher公司。膜片鉗放大器(德國HEKA EPC10)；倒置顯微鏡(TE2000-U，日本Nikon)；三維顯微操作儀(美國Sutter MP285)；數據采集軟件(美國Patchmaster 2.0)；數據分析軟件(美國Origin 8.0)；電極拉制儀(日本Narishige Model PC-10)；玻璃電極毛坯(美國Sutter BF150-110-10型)。

Tab 1 siRNA sequence

1.3 細胞培養分組與干預方法取第4～6代細胞用于實驗，將細胞在平滑肌細胞完全培養基(smooth muscle growth medium，SMGM)中培養24 h后，更換成SMBM繼續培養24 h，再更換成含2% FBS SMBM繼續培養用于后續實驗。分組如下，常氧對照組(Nor)：PASMCs于常氧孵箱(21% O2)中常規培養72 h；低氧對照組(Hyp)：PASMCs于低氧孵箱(3% O2)中培養72 h；低氧+西地那非組(Hyp+Sil)：西地那非(100 nmol·L-1)干預低氧孵箱中的PASMCs 72 h；低氧+西地那非+KT-5823組(Hyp+Sil+KT-5823)：西地那非(100 nmol·L-1)與KT-5823(300 nmol·L-1)共同干預低氧孵箱中的PASMCs 72 h；低氧+西地那非+siRNA-Kv1.5組(Hyp+Sil+siRNA-Kv1.5)：用加入siRNA-Kv1.5 lipo2000混合液的培養基于常氧孵箱中培養PASMCs 6 h，再更換成含2% FBS SMBM，加入西地那非后于低氧孵箱中繼續培養72 h。

1.4 實驗方法

1.4.1DAPI染色法檢測細胞增殖 將細胞接種于直徑12 mm的圓玻片上分組培養72 h，PBS沖洗后用冷4%多聚甲醛固定細胞，再透化處理細胞后PBS沖洗。每片取200 μL DAPI液(1 μg·mL-1)于室溫避光孵育細胞，PBS沖洗。將圓玻片置于熒光顯微鏡下觀察，每張片子于高倍鏡(×200)視野下隨機選擇4個視野，計算其細胞數目并取其均值。

1.4.2細胞免疫熒光染色法檢測細胞增殖 根據實驗分組將細胞接種于預先置入小玻片的六孔細胞培養板中培養72 h，D-PBS沖洗玻片，接著4%多聚甲醛室溫固定玻片。然后用2%的BSA/D-PBS洗，接著用10%羊血清封閉。透化緩沖液室溫孵育。抗體anti-Ki67(1 ∶100)4 ℃作用于玻片過夜，再沖洗。二抗(Alexa Fluor 594標記的兔抗人IgG，1 ∶100)于室溫孵育玻片， D-PBS洗后封片。將每張玻片于熒光正置顯微鏡高倍鏡(×200)視野下觀察，隨機選擇5個視野計算DAPI染核細胞核數目(藍色熒光)、Ki67陽性染色細胞數目(紅色熒光)并取其均值。采用LEICA QWin Plus軟件分析，以Ki67陽性細胞百分數(紅色熒光細胞數目/藍色熒光細胞核數目)代表細胞增殖程度。

1.4.3MTT法檢測細胞增殖 將細胞懸液接種于96孔板，進行細胞實驗分組。第一組細胞于實驗當天(即d 0)加入MTT，其余組細胞于72 h后加入MTT，添加助溶劑，于搖床上混勻使甲瓚顆粒充分溶解，采用酶標儀檢測波長490 nm波長處各孔光吸收值，即為甲瓚的生成量。

1.4.4Western blot法檢測siRNA沉默后的Kv1.5表達 測定低氧下西地那非孵育沉默Kv1.5的細胞上的Kv1.5表達水平。提取全細胞蛋白，制備蛋白樣品，取20 μL(40 μg)全細胞蛋白電泳樣品，進行SDS-PAGE電泳，隨后電轉至PVDF 膜上，封閉液室溫封閉1 h，洗膜后用一抗Kv1.5兔源性多克隆抗體(1 ∶50)于4 ℃孵育過夜，次日取出置于搖床上室溫再作用1 h，漂洗膜，接著用二抗羊抗兔IgG溶液(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，漂洗后進行掃膜。將膜置于Odyssey紅外熒光成像儀中進行拍照，采用ImageJ 1.38圖像軟件分析其熒光強度，得出目的蛋白Kv1.5與β-actin的比值，即為Kv1.5蛋白的相對表達水平。

1.4.5細胞轉染與分組 轉染組分為4組：① 陰性對照組(NC組)；② 空白對照組(BC組)；③ siRNA-Kv1.5組(s1組)、④ siRNA-Kv1.5組(s8組)。用帶有熒光標記的陰性對照siRNA 優化轉染條件，評價轉染效率；Western blot 法檢測干擾前后Kv1.5蛋白表達情況。用siRNA-Kv1.5 lipo 2000混合液孵育細胞6 h，更換新鮮培養基同時加入西地那非干預細胞，于低氧孵箱中培養72 h用于后續實驗。

1.4.6電生理實驗的溶液配制記錄Kv通道電流的溶液配方：電極內液配方(mmol·L-1)：135 KCl，4 MgCl2，10 HEPES，10 EGTA，5 Na2ATP(KOH調節pH至7.2)；浴液配方(mmol·L-1)：141 NaCl，4.7 KCl，3.0 MgCl2·6H2O，10 HEPES，1 EGTA，10 Glucose(NaOH調節pH至7.4)；電極內液中高濃度的Na2ATP用于抑制ATP敏感性鉀通道電流；電極內液及浴液均不含Ca2+，且添加了Ca2+螯合劑，以最大限度地抑制大電導鈣激活性鉀通道活性，以避免其干擾。從而所記錄的基本為Kv電流[3]。以上實驗均在室溫下進行。

1.4.7全細胞膜片鉗記錄 應用膜片鉗技術，檢測各組間細胞的全細胞K+電流，采用Step-Kv全細胞記錄模式(見Fig 1)。在倒置顯微鏡(TE2000-U)下選擇貼壁良好、形狀規則、邊緣清楚、表面光滑、無收縮的細胞。在封接電阻>1 GΩ形成高阻封接的全細胞模式下，將細胞膜電位鉗制在-70 mV，發放步階脈沖電壓刺激，以20 mV為步階，從-60 mV逐步階越至+80 mV，持續時間300 ms，記錄全細胞K+電流。

1.4.8全細胞K+電流的采集及分析 全細胞K+電流信號經膜片鉗放大器輸入數模轉換器PatchMaster EPC10(HEKA Electronikes,Lambrecht，Germany)采集后輸入計算機。實驗過程中通過PatchMaster 2.0軟件補償電極電容，設置放大器增益100 mV·pA-1，采樣頻率10 KHz，低通濾波2.9～1.0 KHz。PatchMaster 2.0軟件進行采集記錄，Origin 8.0(Origin Lab，Northampton，MA)和Microsoft Excel 2010軟件進行數據統計分析。記錄不同電壓刺激下的K+通道電流，同時記錄加入5 mmol·L-1TEA(K+通道阻斷劑)前后K+通道電流幅值及密度。

Fig 1 Protocol of step voltage stimulation in whole-cell patch clamp recording

1.5 統計學方法采用SPSS 12.0軟件對數據進行處理，實驗數據計數資料以均數±標準差表示。應用Prism 5.0軟件進行統計學分析及繪圖，兩組數據間差異用Student’s t-test。多組間資料采用One-way ANOVA方差分析，然后Student-Newman-Keuls(SNK)方法檢驗。

2 結果

2.1 西地那非抑制低氧刺激的PASMCs增殖MTT結果如Fig 2顯示：低氧較常氧對照組可明顯促進PASMCs增殖(P<0.01)。在低氧下用西地那非共孵育細胞，采用DAPI染核計數，結果如Fig 3顯示：西地那非組較低氧對照組可顯著減少低氧刺激的細胞DAPI染核數量(P<0.05)。細胞免疫熒光染色法檢測增殖核性抗原Ki67的結果如Fig 4顯示：低氧較常氧對照組可顯著增加Ki67陽性染色細胞數目；西地那非組較低氧對照組可明顯減少低氧下的Ki67陽性染色細胞數量(P<0.01)。以上表明西地那非能夠抗低氧刺激的人PASMCs增殖。

Fig 2 Proliferation of human PASMCs

PASMCs were incubated under normoxia (Nor) and hypoxia (Hyp),respectively.**P<0.01vsNor.

Fig 3 Hypoxia-induced human PASMC proliferation inhibited by sildenafil

A: Result of DAPI staining (200×); B: Statistical result. PASMCs were incubated under normoxia (Nor),hypoxia(Hyp) or hypoxia with sildenafil treatment(Hyp+Sil),respectively.**P<0.01vsNor;#P<0.05vsHyp.

2.2 西地那非翻轉了低氧刺激的PASMCs的K+通道電流尤其Kv1.5通道電流的降低接下來為了探討西地那非抗低氧刺激的PASMCs增殖是否與K+通道電流變化相關，本研究采用膜片鉗技術記錄細胞K+通道基礎電流。結果如Fig 5所示：低氧下的細胞K+通道基礎電流較常氧對照組明顯降低(P<0.01)；低氧對照組西地那非明顯翻轉了低氧刺激的K+通道基礎電流的降低效應(P<0.05)。接著在膜片鉗全細胞記錄模式下采用5 mmol·L-1TEA(被認為能夠阻斷Kv通道)灌流細胞浴液，以觀察西地那非組的K+電流，以進一步驗證西地那非所增加的細胞K+電流成分是否含Kv通道電流。結果如Fig 6所示：與低氧下對照組相比，TEA抑制了西地那非所增加的K+通道電流(P<0.05)。提示西地那非翻轉的主要是Kv通道電流。為了進一步觀察Kv1.5是否為西地那非翻轉的Kv通道電流成分，記錄在電極內液中加入特異性Kv1.5抗體(1 ∶125)前后的電流值，這兩組電流差值代表西地那非翻轉低氧降低的Kv1.5電流(即Kv1.5抗體效應值)。結果如Fig 7所示：Kv1.5抗體透析使低氧下西地那非組的K+電流降低了28%(P<0.01)，而低氧對照組的K+電流無明顯變化。

A: Result of Ki67 positive cell nuclei (200×); B:Statistical result.**P<0.01vsNor;##P<0.01vsHyp.

2.3 沉默Kv1.5基因對Kv1.5蛋白及西地那非抗低氧刺激的細胞增殖的影響利用優化好的轉染條件，將兩對干擾Kv1.5基因的siRNA(s1,s8)分別轉染細胞。Western blot結果如Fig 8所示：s1、s8對Kv1.5蛋白的干擾效率分別是51.3%、60.2%。與對照組相比，沉默Kv1.5基因的siRNA(s1)組的低氧下西地那非干預的細胞Kv1.5蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，s8組的Kv1.5蛋白表達水平也明顯降低(P<0.01)。MTT結果如Fig 9所示：與對照組相比，siRNA(s1)組的低氧下西地那非干預的細胞活力明顯增強(P<0.05)，s8組的細胞活力也明顯增強(P<0.01)。以上表明沉默Kv1.5基因能夠逆轉西地那非對低氧刺激的細胞增殖的抑制作用。從而間接證明西地那非可能通過上調Kv1.5表達起到抗低氧刺激的細胞增殖作用。

Fig 5 Hypoxia-decreased K+ currents in human PASMCs reversed by sildenafil

A: Representative whole-cell K+currents elicited by depolarizing the cells to a series of test potentials ranging from -60 mV to +80 mV in 20mV increments from a holding potential of -70 mV in PASMC incubated under normoxia (Nor) and hypoxia(Hyp) or hypoxia with sildenafil treatment(Hyp+Sil),respectively. B: Composite current-voltage (I-V) relationship curves from PASMCs cultured in respective conditions.**P<0.01vsNor;#P<0.05vsHyp.

Fig 6 Sildenafil-increased K+ current in human PASMCs exposed to hypoxia inhibited by TEA

A:Representative whole-cell K+current trace from PASMCs pretreated with sildenafil before (Hyp+Sil) and after induced by TEA (Hyp+Sil+TEA). B: Composite current-voltage (I-V) relationship curves.*P<0.05vsHyp+Sil.

2.4 PKG抑制劑KT-5823逆轉西地那非抗低氧刺激的細胞增殖細胞免疫熒光染色Ki67及MTT法檢測低氧下西地那非與PKG抑制劑KT-5823共孵育對細胞增殖的影響，結果如Fig 10所示：KT-5823能夠逆轉西地那非抗低氧刺激的細胞增殖作用(P<0.05)。

Fig 7 K+ currents recorded from human PASMCs pretreated

**P<0.01vsBefore anti-Kv1.5 dialysis

2.5 KT-5823抑制西地那非對低氧下細胞 K+通道電流的上調作用接著為了觀察KT-5823逆轉西地那非抗細胞增殖作用是否與K+通道活性變化有關。在膜片鉗全細胞記錄模式下，我們記錄了低氧下KT-5823與西地那非共孵育細胞前后的K+通道電流，結果如Fig 11所示：KT-5823部分阻斷了低氧下西地那非對K+通道電流的上調作用，K+通道電流降低了34.6%(P<0.05)。以上提示，KT-5823通過阻斷低氧下西地那非對K+通道電流的上調，從而逆轉西地那非抗低氧刺激的細胞增殖作用。

3 討論

肺動脈壓升高和肺血管重構是HPH的主要病理生理特征。大量研究證實，低氧引起的PASMCs增殖是導致肺血管重構的重要環節之一，Kv通道異常與肺動脈高壓及肺血管重構關系密切[4,5]。低氧引起PASMCs的Kv通道活性和表達降低，細胞膜發生去極化，引起胞內的Ca2+濃度增加，導致肺血管收縮、肺動脈壓漸進性升高和PASMCs過度增殖甚至肺血管重構[6]。因此，通過何種途徑干預和調控Kv通道成為防治肺動脈高壓的熱點。西地那非在臨床上用來治療肺動脈高壓，它不僅能抑制肺血管收縮、擴張肺血管、降低肺動脈壓力，同時也可以抑制PASMCs增殖導致的肺血管重構[7]。

Fig 8 Expression of Kv1.5 protein in human PASMCs pretreated with sildenafil under hypoxia inhibited by silencing

A: Kv1.5 protein expression after silencing Kv1.5 gene with siRNA. B: Statistical graph. NC: negative control. BC: Blank control. s1,s8: siRNA.*P<0.05,**P<0.01vsHyp+Sil

Fig 9 The inhibitory effect of sildenafil on hypoxia-stimulatedcell proliferation reversed by silencing Kv1.5 gene

Statistical result of cell viability.*P<0.05,**P<0.01vsHyp+Sil.

Fig 10 The inhibitory effect of sildenafil on hypoxia-stimulated cell proliferation reversed by

A: Statistical result of Ki67 positive cell nuclei. B: Statistical result of cell viability from PASMCs without (Hyp+Sil) or with KT-5823 (Hyp+Sil+KT-5823) treatment in the presence of sildenafil under hypoxia.**P<0.01vsHyp;#P<0.05vsHyp+Sil.

本研究發現，西地那非能抗低氧刺激的PASMCs增殖；低氧引起PASMCs的Kv通道尤其Kv1.5通道電流幅度降低；西地那非能夠逆轉低氧對Kv通道電流尤其Kv1.5通道電流的下調作用；根據靶基因Kv.1.5設計的siRNA(s1、s8)同時用于實驗，因為這兩對siRNA可互為脫靶對照，可以最大程度地避免脫靶效應的影響。經我們實驗篩選得到了沉默效率較高的siRNA序列(s1、s8)，體現在細胞Kv.1.5蛋白表達水平不同，由于Kv.1.5基因及蛋白表達在低氧刺激的PASMCs細胞增殖中起著關鍵作用，因此s1、s8沉默靶基因Kv1.5導致西地那非干預下的低氧刺激的細胞增殖水平不同,有力地提示了西地那非抗低氧刺激的細胞增殖效應可能與Kv1.5基因及蛋白表達的上調有關。KT-5823能夠逆轉西地那非抗低氧刺激的細胞增殖效應，可能與KT-5823阻斷低氧下西地那非對K+通道電流的上調作用有關。因此，本研究表明西地那非通過上調Kv通道亞型Kv1.5抑制低氧刺激的人PASMCs增殖，且可能與PKG通路激活有關。

Fig 11 Sildenafil-increased K+ currents of human PASMCs under hypoxia reversed by

A:Representative whole-cell K+current trace.B:Composite current-voltage(I-V) relationship curves.**P<0.01vsHyp;#P<0.05vsHyp+Sil.

近年來的研究發現低氧可通過各種信號通路引起肺血管功能和結構發生改變，其中低氧是始動的關鍵因素[8]。Kv作為K+通道主要亞型，被認為是PASMCs的主要氧感受器。Kv通道電流是細胞膜電位的主要組分，研究發現氧敏感性Kv通道主要包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1等亞型，它們的表達和功能異常是引起細胞膜電位去極化，促進PASMCs增殖導致肺血管重構的重要因素之一[9]。有研究報道，Kv1.5在調控細胞膜電位及低氧性PASMCs增殖方面尤為重要[10]。存在Kv1.5基因突變的PASMCs在低氧刺激下，細胞增殖被顯著抑制[11]。本研究中采用siRNA沉默Kv1.5基因后，西地那非的抗細胞增殖效應被抑制，與文獻報道結論一致。低氧抑制氧敏感性Kv1.5通道表達與功能是引起PASMCs過度增殖的重要機制。低氧使Kv通道的表達與功能降低，進而細胞膜發生去極化，電壓依賴性鈣通道開放，導致Ca2+內流，胞內的Ca2+濃度增加，從而促進細胞有絲分裂，加快細胞進入細胞周期；另外，Ca2+還能夠激活胞內的多種依賴Ca2+的信號轉導蛋白，直接或間接促進細胞增殖[12]。由此證明Kv通道是調節細胞膜電位和胞內的Ca2+濃度的效應器。因此，阻斷低氧抑制的Kv通道，有可能成為防治肺動脈高壓的重要途徑之一。

肺動脈高壓時肺血管平滑肌細胞內的PDE5表達和活性明顯增加，西地那非作為一種選擇性PDE5抑制劑，其機制主要是通過抑制PDE5活性，顯著地減少PDE5對cGMP的降解，從而升高cGMP水平，進而發揮治療作用，其PDE5/cGMP/PKG信號通路在調節血管張力、細胞增殖等過程中起重要作用。cGMP是PASMCs內重要的第二信使，不僅能夠降低胞內的Ca2+濃度，從而促進肺血管舒張，降低PASMCs增殖，而且能夠促進細胞凋亡[13]。另外，一氧化氮通過激活平滑肌細胞內的可溶性鳥苷酸環化酶，催化三磷酸鳥苷轉化生成cGMP，激活其下游的蛋白激酶PKG，開放K+通道，細胞膜電位發生超極化，引起電壓依賴性鈣通道失活，Ca2+內流減少，胞內的Ca2+水平降低[14]。此外，PKG還可通過抑制肌醇三磷酸釋放或調控三磷酸肌醇受體減少胞內鈣庫Ca2+的釋放，使平滑肌細胞內的Ca2+水平降低，從而抑制血管平滑肌收縮，同時降低PASMCs增殖[15]。

本研究發現，西地那非可能通過上調Kv通道，尤其是Kv1.5通道抑制低氧刺激的人PASMCs增殖，且可能與PKG信號通路激活有關。但無論通過何種細胞內信號轉導途徑，低氧終會通過改變細胞膜上的Kv通道功能，影響細胞內Ca2+水平。進一步探討低氧刺激的Kv通道功能降低、胞內的Ca2+濃度異常升高的分子機制，找到阻斷這種Ca2+異常升高途徑的有效切入點，對于改善肺血管重構具有重要意義。