基于中效方程的黃芩苷與小檗堿抗炎協(xié)同作用研究

蔣 晴，羅 煜，朱正文，梁雨生，吳嘉思，蘇絲雨，曾 勇，孟憲麗，王 平

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

黃芩苷和小檗堿分別是清熱解毒藥黃芩和黃連及其復(fù)方口服后主要的入血成分[1]，二者體內(nèi)外實驗均表現(xiàn)出良好的抗炎活性[2,3]，但聯(lián)合應(yīng)用的合理性研究還未見報道。本實驗研究黃芩苷和小檗堿聯(lián)合對經(jīng)典炎癥通路關(guān)鍵節(jié)點的影響，評價二者合用相關(guān)機制。

1 材料

1.1 細胞小鼠腹腔巨噬細胞株(RAW 264.7)，購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 藥物與試劑黃芩苷(批號AF7061702)、鹽酸小檗堿(批號AF8011015)、穿心蓮內(nèi)酯(批號AF7072353)，購自成都埃法生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 檢測試劑盒(批號A28281022)、白介素-6(IL-6)檢測試劑盒(批號A20680724)，購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒(批號S0021，碧云天生物研究所)；磷酸化蛋白核因子κB p65(phospho- nuclear factor kappa B p65，p-p65)、p65、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體(美國Cell Signaling 公司)。

1.3 儀器AE2000雙目顯微鏡(Motic)；二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀(Thermo Scientific)；蛋白垂直電泳儀(Bio-Rad)。

Tab 1 Drug concentration table

Bai: baicalin. Ber: berberine.

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)RAW 264.7細胞。

2.2 細胞分組、給藥、取樣及炎癥關(guān)鍵指標的檢測取對數(shù)生長期細胞于24孔板，分組含：空白對照組、模型組(LPS=100 ng·mL-1)、陽性藥物組(LPS+穿心蓮內(nèi)酯10 μmol·L-1)、各劑量給藥組(LPS+聯(lián)合藥物、LPS+黃芩苷、LPS+小檗堿)，給藥濃度見表1。給藥30 min后除空白孔外每孔加入LPS造模，各平行板LPS分別刺激50 min、4 h、12 h后，吸取培養(yǎng)上清液，用于TNF-α、IL-6、NO的檢測。

取對數(shù)生長期細胞于6孔板，同上方各濃度分組操作。分別于LPS刺激2 h、12 h后，提取和變性蛋白，用于p-p65、iNOS的檢測。

按試劑盒說明書操作測定細胞因子水平，通過Western blot檢測蛋白表達水平。

2.3 藥物聯(lián)合作用評價Chou-Talalay[4]的中效方程是一種能準確分析藥物配伍使用效果有無協(xié)同、拮抗或加和的定量分析法，如實驗數(shù)據(jù)不呈對數(shù)線性關(guān)系，以fa/fu值對劑量梯度作圖，可直觀得出結(jié)論。本實驗對所得三組fa/fu—劑量關(guān)系圖評測，評價二者的聯(lián)合作用。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法通過SPSS15.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，處理組間差異性。

3 結(jié)果

3.1 蛋白表達測定結(jié)果小檗堿在實驗劑量下呈劑量依賴性地抑制NF-κB的磷酸化 (P<0.05)，對iNOS表達無相關(guān)作用；而黃芩苷對NF-κB磷酸化、iNOS表達的抑制作用極微弱；fa/fu—劑量關(guān)系圖顯示聯(lián)用對NF-κB磷酸化的抑制具有拮抗作用，對iNOS表達的抑制呈現(xiàn)加和作用。

3.2 細胞因子水平測定結(jié)果黃芩苷呈劑量依賴性地抑制NO的釋放，最高濃度下對IL-6的釋放具有一定抑制作用(P<0.05 )；小檗堿在實驗劑量下對NO、IL-6的釋放無相關(guān)抑制作用；二者對TNF-α均具有微弱的抑制作用；fa/fu—劑量關(guān)系圖顯示，二者合用對NO釋放的抑制表現(xiàn)為加和作用，對IL-6、TNF-α釋放的抑制呈現(xiàn)較弱的拮抗作用。

4 討論

黃芩苷和小檗堿在單味藥及復(fù)方中均有良好吸收，是發(fā)揮療效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，從二者合用的藥效改變可探索復(fù)方的組織機理。本實驗通過相關(guān)藥代動力學(xué)資料[1,5]確定黃芩苷和小檗堿的摩爾濃度配比為49 ∶1，以反映二者在體內(nèi)出現(xiàn)的分子比的現(xiàn)實情況，對炎癥通路關(guān)鍵節(jié)點[6,7]的影響測定發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和小檗堿聯(lián)用對抑制p65磷酸化及TNF-α、IL-6釋放均存在一定拮抗作用，可能由于二者結(jié)合導(dǎo)致擴散轉(zhuǎn)運入胞內(nèi)的總有效成分降低；更重要的是，兩者合用時小檗堿對抑制NF-κB p65靶點起主導(dǎo)作用，而黃芩苷對抑制IL-6、iNOS及NO釋放起主導(dǎo)作用，提示在復(fù)方應(yīng)用中，黃芩苷和小檗堿并非通過共同干預(yù)同一靶標發(fā)揮協(xié)同作用，而是側(cè)重于調(diào)控不同靶點，影響不同分子網(wǎng)絡(luò)，互補調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)協(xié)同效應(yīng)，這可能也是中藥組方配伍精髓所在。