丹酚酸B對高糖誘導心肌成纖維細胞增殖及轉分化的作用研究

王 娜，隋海娟，符麗娟

(1.錦州醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，遼寧 錦州 121000; 2.朝陽市第二醫院藥劑科，遼寧 朝陽 122000)

糖尿病心肌病是糖尿病患者主要的心臟并發癥，心肌間質纖維化為其主要病理改變，也是引起糖尿病心室重塑導致心力衰竭的關鍵原因；其表現為心肌間質細胞增殖及表型轉分化，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積等。Wnt/β-catenin信號通路是參與細胞生長、增殖的重要途徑，與肺、肝臟及腎臟等多臟器纖維增生性疾病的發生密切相關[1-3]；Wnt/β-catenin通路的激活也參與了糖尿病心臟重構的病理過程[4]。目前，針對Wnt/β-catenin通路抑制劑的研究已成為防治纖維化相關疾病藥物研究的重要靶點。丹酚酸 B(salvianolic acid B，Sal B)是用于心血管系統疾病的傳統中藥丹參的主要活性成分，基礎研究發現[5,6]其對多種心血管損傷具有一定保護作用，如心肌缺血/再灌注損傷、2型糖尿病小鼠心肌病變等。但有關Sal B對糖尿病心肌纖維化的具體作用目前尚不明確，本研究通過體外培養心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)，高糖誘導模擬糖尿病高糖狀態，基于Wnt/β-catenin信號通路，觀察Sal B對高糖誘導CFs增殖及轉分化的影響，探討Sal B對糖尿病心肌間質纖維化的作用及可能機制，為傳統中藥防治糖尿病心肌病變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物、藥品與試劑 1～3 d齡新生SD大鼠乳鼠(錦州醫科大學實驗動物中心提供)，動物使用許可證號：SCXK(遼)2016-0004。Sal B(美侖MB6598)；Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939(APEX BIO A1877)。DMEM培養基(Mediatech公司)；增強型CCK-8試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司)；α-SMA抗體(博士德公司WL02509)；β-catenin抗體(abcam公司ab32572)；p-GSK 3β 抗體(abcam公司ARG51777)。

1.1.2儀器 CO2孵箱(三洋公司)；相差顯微鏡(Olympus公司)； Mini-REPOTEANⅡ型電泳槽、電泳儀、Semi-dry Transfer cell(Bio-Red公司)；TGL-16G高速冷凍離心機(日立公司)；Biocell 2010酶標儀(Anthos Labtec Instruments公司)；數顯氣浴恒溫震蕩器(江蘇CHA-SA)；化學發光凝膠系統分析儀(美國UVP公司)；Leica 4000B正置熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1CFs分離與培養 新生SD大鼠乳鼠，♀ ♂不拘，體積分數75%的乙醇消毒，取出心臟，冷PBS沖洗2次，放于冷培養基中，剪約1 mm3組織碎塊，加入0.25% 胰酶37 ℃水浴中進行消化。將消化的上清加至含10%胎牛血清的培養基中終止消化。將收集的細胞1 000×g離心10 min，棄去上清。向沉淀中加入含10%胎牛血清的培養基，吹打均勻，制成細胞懸液。剩余組織繼續按上述操作消化至組織消化完全，之后將細胞懸液均勻接種于培養瓶中，放入37 ℃、5% CO2孵箱。差速貼壁90 min后，棄去培養液，PBS沖洗細胞3次，更換新的培養基。細胞生長近融合狀態時0.25% 胰酶消化傳代，本實驗使用2～3代細胞。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖 將對數生長期的CFs胰酶消化后，用培養液制成單個細胞懸液計數，以每孔300個細胞接種至96孔板，每孔100 μL，貼壁培養24 h，吸去上清，加無血清培養基，血清饑餓24 h。分別進行：① 不同濃度葡萄糖對CFs增殖的作用：分為正常對照組(Control，含5.5 mmol·L-1葡萄糖)和葡萄糖組(含10、20、25、30、50 mmol·L-1葡萄糖)；② 高糖誘導 CFs增殖的時間效應：分為 Control組，高糖組(HG組，含25 mmol·L-1葡萄糖)，作用時間分為 12 h、 24 h、48 h；③Sal B對高糖誘導 CFs增殖的作用：分為 Control組、HG組(25 mmol·L-1)、HG+ Sal B(12.5、25、50 μmol·L-1)、高滲透壓對照組 (MG組，含 5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇)。按上述不同的處理因素作用48 h，每組設 6復孔。每孔加入CCK-8試劑10 μL，輕輕搖晃96 孔板后放入37 ℃ 5% CO2培養箱中繼續培養1 h，取出96孔板置于酶標儀上，490 nm測定各孔吸光度OD值。

1.2.3分組及藥物處理 實驗分為：① Control組(含5.5 mmol·L-1葡萄糖)，②MG組(含5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇)，③ HG組 (含25 mmol·L-1葡萄糖)，④ HG + Sal B組(25 μmol·L-1Sal B預處理細胞1 h，加25 mmol·L-1葡萄糖)，⑤ HG+XAV939組(1 μmol·L-1XAV939預處理細胞 1 h，加25 mmol·L-1葡萄糖)，⑥ XAV939組(1 μmol·L-1)，⑦ Sal B組(25 μmol·L-1)。

1.2.4苦味酸天狼猩紅染色 取出藥物作用后的24 孔培養板，棄掉培養基， PBS 清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS清洗3次，0.5% 的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)破膜20 min，PBS 清洗3 次，天狼猩紅染液染色1 h，蘇木素染液復染細胞核5 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5免疫熒光法 各組CFs加不同條件培養基藥物處理24 h后，吸去培養液，冷PBS 漂洗3次；新鮮配制4% 多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 漂洗3次；0.3% Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3 次；室溫山羊血清工作液封閉60 min；滴加α-SMA一抗溶液，4 ℃孵育過夜；PBS漂洗，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的二抗室溫孵育1 h，PBS漂洗，用含DAPI的抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察及拍照。

1.2.6Western blot 各組CFs加不同條件培養基藥物處理24 h后，冷PBS沖洗3次，立即放入預冷的裂解液中，每隔5 min震蕩20 s，4 ℃ 12 000×g離心，取上清，BCA法進行蛋白質定量。每個泳道蛋白上樣量為20 μg，行 SDS-PAGE凝膠電泳，觀察Marker移動情況。電泳后將凝膠中的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，分別加兔抗大鼠α-SMA一抗、兔抗大鼠 β-catenin一抗、兔抗大鼠p-GSK 3β 一抗、兔抗大鼠GSK 3β 一抗，4 ℃孵育過夜。次日早上取出膜，TBST洗膜3次，每次10 min，將膜放入山羊抗兔二抗 (1 ∶1 000)中，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，行ECL化學發光顯影。利用 Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析。實驗重復3次。

1.2.7統計學方法 實驗數據用表示，SPSS 18.0軟件進行統計學分析。采用One-way ANOVA和LSD-t檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖對CFs增殖的作用CCK-8結果(Tab 1)顯示，不同濃度(5.5、10、20、25、30、50 mmol·L-1)葡萄糖誘導CFs 24 h，25、30、50 mmol·L-1葡萄糖誘導，CFs增殖率明顯增加，實驗中25 mmol·L-1高糖誘導時細胞增殖率已經達到196 %(P<0.01)，本實驗確定高糖誘導濃度為25 mmol·L-1。

Tab 1 Effects of different concentrations of glucoseon

GroupConcentration/mmol·L-1OD490Proliferationrate/%Control5.50.276±0.016100.00HG100.278±0.020100.79200.291±0.038105.50250.541±0.277??196.07300.572±0.226??207.56500.571±0.321??207.25

**P<0.01vscontrol

2.2 高糖誘導CFs增殖時間效應根據Tab 1結果，應用25 mmol·L-1葡萄糖作用12、24及48 h，結果(Tab 2)顯示，作用24 h時CFs增殖率最高，達到204.6%(P<0.01)，本實驗確定高糖作用時間為24 h。

Tab 2 Time effect of high glucose on proliferation

GroupTime/hOD490Proliferationrate/%Control120.267±0.026100.00HG120.294±0.022110.11Control240.304±0.019100.00HG240.623±0.019??204.60Control480.397±0.027100.00HG480.503±0.044??126.80

**P<0.01vscontrol

2.3 不同濃度Sal B對CFs增殖的影響CCK-8結果(Tab 3)顯示，與Control組相比，MG組CFs無明顯變化，提示高滲透壓對CFs增殖無明顯影響，而25 mmol·L-1高糖作用可促進CFs增殖(P<0.01)；與HG組相比，經不同劑量(12.5、25、50 μmol·L-1)Sal B 干預，對CFs增殖均出現抑制作用(P<0.05)，25 μmol·L-1差異具有極顯著性(P<0.01)，后續實驗選取Sal B的給藥濃度為25 μmol·L-1。

2.4 Sal B對高糖誘導CFs膠原纖維表達的影響天狼猩紅染色(Fig 1)顯示：倒置顯微鏡下，膠原纖維為粉紅色，細胞核為紫紅色。與Control組相比，HG組細胞數量增多，紅色膠原面積明顯增加。與HG組相比，經Sal B以及XAV939預處理后，紅色膠原面積減少，細胞間隙變大；單獨應用Sal B及XAV939對CFs膠原纖維表達無明顯影響。表明Sal B可通過抑制Wnt/β-catenin信號途徑減少高糖誘導CFs膠原沉積。

Tab 3 Effects of different concentrations of Sal B

GroupConcentration/mmol·L-1OD490Proliferationrate/%Control0.307±0.021100.00MG0.306±0.02999.78HG0.595±0.010??193.71HG+Sal B12.50.560±0.033#182.15250.374±0.023##121.60500.363±0.009##118.18

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG

2.5 Sal B對高糖誘導CFsα-SMA表達的影響免疫熒光(Fig 2)顯示：紅色熒光代表α-SMA，藍色熒光為細胞核，與Control組相比，HG組細胞紅色熒光明顯增強；與HG組相比，經Sal B(25 μmol·L-1)以及XAV939預處理后，紅色熒光強度明顯減弱；單獨Sal B組及單獨XAV939組與Control組相比熒光強度變化不明顯。

Western blot(Fig 3)顯示：與Control組相比，HG組α-SMA蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與HG組相比，HG+XAV939組與HG+Sal B組α-SMA蛋白水平降低(P<0.01)，HG+XAV939組降低更為明顯；單獨Sal B組及單獨XAV939組與Control組相比無明顯變化。α-SMA為肌成纖維細胞的標志性蛋白，提示高糖可誘導CFs轉分化為肌成纖維細胞，

Fig 1 Effects of Sal B on expression of collagen fiber in CFs induced by high glucose(400×)

A：Control group;B：HG group; C：HG + Sal B group; D：HG + XAV939 group; E：XAV939 group; F：Sal B group

Fig 2 Effect of Sal B on expression of α-SMA in CFs induced by high glucose(400 ×)

Sal B以及抑制Wnt/β-catenin信號可阻止高糖誘導CFs轉分化程度。

2.6 Sal B對高糖誘導CFs β-catenin、 p-GSK 3β表達影響Western blot(Fig3)顯示：與Control 組相比，HG組β-catenin、p-GSK 3β蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與HG組相比，HG+XAV939組與HG+Sal B組β-catenin、p-GSK 3β蛋白水平降低(P<0.01)，HG+XAV939 組降低更為明顯；單獨Sal B組及單獨XAV939組與Control組相比無明顯變化。表明Sal B可通過下調 β-catenin、 p-GSK 3β表達抑制高糖誘導CFs增殖及轉分化程度。

Fig 3 Effects of Sal B on expression of α-SMA,β-catenin

1：Control group; 2：HG group; 3：HG + Sal B group;4：HG + XAV939 group; 5：XAV939 group;6：Sal B group;**P<0.01vsControl group;##P<0.01vsHG group

3 討論

CFs是心肌間質的主要細胞成分，糖尿病狀態下CFs增殖可合成大量膠原，ECM合成增加，導致心肌間質纖維化。然而，單純CFs增殖不足以完成纖維化進程，CFs轉分化(即CFs轉分化為肌成纖維細胞)則是心肌間質纖維化進展的關鍵所在，轉分化作用可導致ECM合成級聯放大，從而加重心肌間質纖維化及心臟重構的病理進程[7]。α-SMA是肌成纖維細胞特征性標志物，本研究中應用高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)誘導，CFs增殖率顯著升高，α-SMA表達增加，膠原纖維增多；證實高糖可誘導CFs增殖轉分化為肌成纖維細胞，特征性α-SMA表達增加，與Tao等[8]報道一致。實驗中經 Sal B(25 μmol·L-1)預處理后，明顯抑制了CFs增殖及膠原纖維沉積，α-SMA表達明顯減少，提示Sal B對高糖誘導CFs增殖及轉分化有一定的抑制作用。

Wnt/β-catenin信號通路是調控組織器官發育的重要途徑，參與細胞增殖、遷移及間質轉化等過程。其中β-catenin在細胞內的數量與狀態對該途徑起決定作用，β-catenin在胞質中積累后進入細胞核，是Wnt信號傳遞的重要環節，β-catenin異常激活參與纖維增生疾病的發生發展[9]。劉理靜等[1]研究顯示，高糖可通過激活β-catenin引起肺成纖維細胞增殖及膠原合成。也有研究顯示，持續血糖可通過激活Wnt/β-catenin/TCF7L2通路，使β-catenin活化參與糖尿病心肌病的病理生理過程[4,10]。本研究中，高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)誘導，CFs內β-catenin表達明顯增加，經Sal B及XAV939預處理后，β-catenin表達明顯減少。提示Sal B可抑制高糖誘導CFs增殖轉分化，其作用與下調β-catenin表達有關。

正常情況下，β-catenin受多種蛋白調控， GSK 3β為其負向調節因素。當無 Wnt 配體時，GSK 3β的調控作用使胞質內β-catenin處于較低水平；當有Wnt配體時，Wnt配體與膜上Frizzled及LRP5/6受體結合，形成復合物，激活胞內的 Dsh，從而抑制GSK 3β活性，阻止胞質內β-catenin的降解；當GSK 3β的N端 9位絲氨酸被磷酸化后，p-GSK 3β增加，降低了GSK 3β活性，從而導致胞質β-catenin過度表達[11]。有學者在小鼠腎間質纖維化的研究中發現，p-GSK 3β水平與 β-catenin 表達同步增加[12]；Liu等[13]發現， Wnt/β-catenin 信號通路在糖尿病誘導的心肌損傷中被激活，推測其與糖尿病誘導的心肌病變的發生有關。本研究中，高糖誘導CFs內p-GSK 3β 與 β-catenin亦出現同步增加；經Sal B及Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939預處理后，p-GSK 3β、β-catenin表達出現同步下調；提示GSK 3β磷酸化，可上調β-catenin表達，使α-SMA表達增多，促進高糖誘導CFs增殖及轉分化；Sal B可通過下調p-GSK 3β、β-catenin表達抑制高糖誘導CFs細胞增殖及轉分化過程。

綜上所述，高糖作用CFs可上調p-GSK 3β與β-catenin表達，促進CFs增殖、轉分化；Sal B可有效抑制高糖誘導CFs增殖及轉分化作用，其機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。