基于膽汁酸穩態調控的維生素D對結直腸癌的抑制作用及機制研究

鐘雅男，陳春霞，趙 峰，郝志翔，徐吟雪，印曉星，周雪妍

(徐州醫科大學藥學院，江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三大惡性腫瘤，其全球發病率、轉移率高且治愈率低[1]。預計至2030年，CRC的全球負擔將增加60%[2]。CRC發病隱匿，早期癥狀多不明顯，缺乏早期診斷的有效標準，因此需對CRC病因學深入研究并探討影響其發生、發展的高危因素。

膽汁酸(bile acids，BAs)是膽汁的主要成分，由肝細胞內膽固醇轉化而來。各類型膽汁酸可分為三類：單體膽汁酸：膽酸(cholic acid，CA)，石膽酸(lithocholic acid，LCA)，脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)，熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)，鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)，豬脫氧膽酸(hyodeoxycholic acid，HDCA)，α-鼠膽酸(α-muricholic acid，α-MCA)，β-鼠膽酸(β-muricholic acid，β-MCA)；膽汁酸的甘氨酸結合產物：甘膽酸(glycocholicacid，G-CA)，甘氨石膽酸(glycinocholic acid，G-LCA)，甘氨脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid，G-DCA)，甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid，G-CDCA)，甘氨熊脫氧膽酸(glycoursodeoxycholic acid，G-UDCA)；膽汁酸的?；撬峤Y合產物：?；悄懰?taurocholic acid，T-CA)，?；敲撗跄懰?taurodeoxycholic acid，T-DCA)，?；切苊撗跄懰?tauroursodeoxycholic acid，T-UDCA)，?；鞘懰?taurocholic acid，T-LCA)，?；蛆Z脫氧膽酸(tauro-chenodeoxycholic acid，T-CDCA)，?；秦i脫氧膽酸(tauro-hyodeoxycholic acid，T-HDCA)，?；铅?鼠膽酸(tauro-β-muricholic acid，T-β-MCA)。各類型膽汁酸總和為總膽酸(total bile acid，TBA)。腸炎狀態下BAs選擇性的在結腸組織中蓄積[3]。其中以疏水性膽汁酸包括CDCA、LCA和DCA最為明顯。LCA刺激結腸黏膜上皮細胞增殖導致CRC的發生發展[4]。而DCA進一步破壞腸道黏膜屏障促進腸道腫瘤的發生[5]。因此，疏水性膽汁酸在結腸組織中的蓄積是CRC發生發展的重要環節。

膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)是影響BAs生成的限速酶。法呢醇受體(farnesoid X receptor，FXR)廣泛分布于與BAs代謝密切相關的器官[6]。FXR參與BAs的負反饋調節，調控體內BAs的合成，從而維持BAs的穩態[7]。因此，FXR和CYP7A1的異常表達介導的BAs穩態變化進一步促進CRC的發生發展。

維生素D(vitamin D，VD)是多功能的類固醇激素，活化的VD通過結合激活VD受體在體內起到調節鈣磷和脂質代謝、發揮抗癌活性等多種生理作用[8]。VD的活性代謝產物25羥維生素D3(25-hydroxyvitamin D3，25(OH)D3)濃度與CRC之間存在強烈的反向相關性。25(OH)D3水平的最低四分位數比最高四分位數的癌癥死亡風險顯著升高。具有較高25(OH)D3水平的患者癌癥特異性和總死亡率明顯降低[9]。因此，VD的缺乏是CRC的危險因素，VD的補充可以抑制CRC的發生發展，但相關的機制仍不明確。

VD在BAs代謝中發揮重要作用，可通過抑制限速酶CYP7A1的表達來抑制BAs合成[10]，而BAs的穩態與CRC的發生發展密切相關。由此，我們推測，VD是否可能作用于BAs穩態進而調控CRC的發生發展。本實驗的研究對象為C57BL/6 ♂小鼠，利用腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)并給予硫酸葡聚糖鈉鹽(Dextran Sulfate Sodium Salt, DSS)誘導建立小鼠CRC模型，通過飼料喂養VD進行治療，考察VD對BAs內穩態的調控與CRC發生發展的聯系，為CRC臨床藥物治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，♂，體質量15 g(4～5周齡)，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養于徐州醫科大學新藥與臨床藥學重點實驗室，許可證號：SCXK(滬)2013-0016，環境溫度(25±2)℃，濕度(55±5)%。實驗期間，各組小鼠均可自由飲水。

1.2 試劑氧化偶氮甲烷(貨號A5486)、去氫膽酸(貨號30830)購自Sigma公司；HE染色試劑盒(貨號C0105)，購自碧云天生物技術有限公司；硫酸葡聚糖鈉鹽(貨號0216011010)，購自美國MP公司；TRNAiso Plus(貨號9108)、PrimeScript RT reagent Kit(貨號RR037A)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(貨號RR820A)，購自寶生物工程(大連)有限公司；AIN-93G標準純化飼料(貨號D10012G)，購自福貝世亨生物醫藥(上海)有限公司。

1.3 儀器Agilent 6420A三重四級桿質譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、MassHunter Qualitative定性分析軟件、MassHunter Quantitative定量分析軟件和MassHunter Acquisition數據采集軟件(美國Agilent公司)；NanoDrop 1 000核酸濃度測定儀(美國Thermo Scientific公司)；Light Cycle 480實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Tecnai G2透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.4 CRC小鼠模型的建立♂C57BL/6小鼠，適應1周后，將小鼠隨機分為3組，每組6只：正常對照組(Control組)、結直腸癌組(CRC組)、結直腸癌+VD補充組(CRC+VD組)。其中，CRC組和CRC+VD組于第1天腹膜內注射AOM(10 mg·kg-1)。第8天起，給予小鼠2.5% DSS水溶液1周作為飲用水，第15天起使小鼠正常飲水2周。第29天起重復第8天到第28天的循環兩次，第70天，造模結束。CRC+VD組在AOM+DSS誘導的CRC模型基礎上，給予含VD33 000 IU·kg-1的AIN-93G標準純化飼料自由飲食。通過眼眶采血收集血液，頸脫位法處死各組小鼠并收集肝臟組織，同時完整地取出結直腸，使用直尺測量結直腸長度，隨后收集結腸組織，樣本均保存于-80 ℃冰箱中。

1.5 HE染色取結腸組織經4%多聚甲醛固定后，按步驟經包埋，切片，再依次脫蠟，染色，脫水，封片，最后晾干。顯微鏡觀察結腸組織的形態結構并拍照記錄。

1.6 qPCR檢測TRIzol提取肝臟組織總RNA，并根據PrimeScript RT說明書步驟逆轉錄成cDNA。利用Roche LightCycle 480軟件計算樣本中各目的基因的Ct值進行定量PCR分析。以GADPH的mRNA水平作為參比對照，采用ΔΔCt法得到各目的基因mRNA的相對表達水平，反應引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。序列見Tab 1。

Tab 1 Primers and amplification length of qPCR reaction

1.7 膽汁酸及其代謝產物的含量測定

1.7.1小鼠血清的膽汁酸提取 精密量取50 mL血清，加入150 μL冰乙腈溶液(I.S.100 ng·mL-1)混勻。4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，吸取大于170 μL上清液。40 ℃旋轉干燥后，濃縮物復溶于100 μL質量分數為50%甲醇溶液(含質量分數為0.1%甲酸)，并在4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min。取上清置于進樣瓶中，最終以20 μL進樣。采用已建立并完成驗證的20種膽汁酸活性物質組分(CDCA、CA、DCA、LCA、G-CA、G-CDCA、T-CDCA、T-DCA、UDCA、HDCA、G-LCA、G-UDCA、G-DCA、T-UDCA、T-HDCA、T-LCA、α-MCA、β-MCA、T-CA和T-β-MCA)的LC-MS/MS定量分析方法[3]。

1.7.2小鼠結腸的膽汁酸提取 精密稱取300 mg結腸組織，用1.2 mL質量分數為70%的乙醇勻漿后，55 ℃超聲提取30 min。4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，取上清。吸取100 μL提取物，加入500 μL冰乙腈溶液混勻。其余步驟同小鼠血清膽汁酸測定。

2 結果

2.1 VD對結直腸癌發生發展的調控作用與Control組相比，CRC組小鼠體質量于5～13周體質量低于Control組(P<0.01)；而CRC+VD組體質量與CRC組相比相對較高，但至造模結束，三組小鼠體質量并無明顯差異，見Fig 1A。結直腸長度結果顯示，CRC組小鼠結直腸長度明顯較Control組短(P<0.01)；而與CRC組相比，CRC+VD組結直腸長度已變長(P<0.01)，見Fig 1B。Fig 1C染色結果顯示，Control組結腸組織基底膜完整，腺體排列規則，結構良好；CRC組結腸組織炎性細胞浸潤，癌組織呈浸潤性生長，細胞排列紊亂，失去正常的結構和層次；CRC+VD組結腸各層結構相對清晰，細胞僅呈現輕度水腫狀態，炎癥情況有所緩解。

2.2 VD對膽汁酸內穩態的調控作用Fig 2結果顯示，血清中20種BAs活性物質的含量分布情況。與Control組比較，CRC組小鼠血清樣本的總膽汁酸水平降低(P<0.01)，見Fig 2D；同時Fig 2A，Fig 2B顯示，CRC組G-UDCA，DCA，HDCA，T-HDCA，UDCA，T-LCA，T-CA，LCA，T-CDCA，CDCA和T-DCA的含量顯著降低(P<0.05)，而α-MCA、β-MCA的含量明顯增加(P<0.05)，表明CRC造模小鼠體內BAs穩態出現紊亂。與CRC組相比，CRC+VD組小鼠血清樣本中T-LCA，LCA，T-CA，T-DCA，T-HDCA水平升高(P<0.05)，α-MCA、β-MCA的含量顯著降低(P<0.05)，見Fig 2B，Fig 2C，提示給予CRC造模小鼠VD后，小鼠血清BAs水平逐漸好轉。

檢測各組小鼠結腸組織中BAs活性物質的含量，與Control組比較，CRC組小鼠結腸組織樣本的總膽汁酸水平升高，見Fig 3D，其中，T-β-MCA、G-DCA、G-LCA、DCA和α-MCA的含量顯著升高(P<0.05)，而T-HDCA、HDCA的含量明顯降低(P<0.05)，見Fig 3A，Fig 3B，同時在小鼠血清樣本中大部分BAs含量降低，而結腸部位卻出現BAs的蓄積，提示在腸炎腸癌狀態下，BAs穩態失衡且蓄積在結腸部位。而與CRC組相比，CRC+VD組小鼠結腸組織中總膽汁酸水平明顯降低(P<0.05)，見Fig 3D，其中G-DCA、CDCA、G-LCA、LCA、α-MCA、T-DCA、DCA、UDCA和HDCA含量均降低(P<0.05)，見Fig 3B，Fig 3C，結果表明給予CRC造模組小鼠VD后，小鼠結腸部位BAs濃度逐漸恢復并趨近于正常水平。

Fig 1 Inhibition of vitamin D on colorectal cancer model

A:Body weight curves of mice; B:The colorectal length of mice; C:The appearance and structure of colon tissue by HE staining.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCRC group.

Fig 2 Effects of vitamin D on bile acids in mouse

A:The concentrations of BAs in serum of control group; B:The concentrations of BAs in serum of CRC group; C:The concentrations of BAs in serum of CRC+VD group. D:The concentrations of total BAs in serum. (1:T-β-MCA;2:G-CA;3:CA;4:G-DCA;5:T-CDCA;6:CDCA;7:G-LCA;8:T-LCA;9:LCA;10:α-MCA;11:G-UDCA;12:T-CA;13:T-DCA;14:DCA;15:β-MCA;16:T-UDCA;17:UDCA;18:G-CDCA;19:T-HDCA;20:HDCA).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCRC group.

通過繪制的BAs含量圖譜發現，結腸部分蓄積的BAs生理活性與毒性均取決于其分子結構的極性。因此，實驗中將疏水性膽汁酸濃度除以膽汁酸總濃度，以此比值作為膽汁酸疏水性大小的指標，Fig 4結果所示，在血清與結腸組織樣本中膽汁酸的疏水性整體趨勢與總體膽汁酸水平的趨勢保持一致。與Control組相比，CRC組小鼠結腸組織中疏水性膽汁酸比例增大(P<0.05)；而VD的補充明顯降低了疏水性膽汁酸的比例(P<0.01)。提示VD的補充能夠減少疏水性膽汁酸在結腸部位的比例失衡及蓄積。

肝臟qPCR方法檢測FXR、CYP7A1的mRNA表達水平(Fig 5)，CRC組中FXR、CYP7A1的mRNA表達與Control組相比明顯升高(P<0.01)，與CRC組小鼠體內BAs水平升高趨勢一致。當給予VD治療后，FXR和CYP7A1表達降低，其中CYP7A1表達量明顯降低(P<0.01)，結果證明了VD可以改善CRC小鼠體內BAs失衡的狀態。

3 討論

CRC是世界四大癌癥死亡原因之一，據預測到2030年，可達220萬個新發病例和110萬例死亡人數[2]。CRC被認為是由環境、飲食、慢性炎癥、胃腸道代謝紊亂等因素綜合作用所導致的癌癥，因其發病隱匿，病因復雜，目前仍沒有有效的治療藥物。因此，對CRC病因學進行深入研究，探討影響其發生發展的高危因素，對CRC臨床干預策略的優化以及疾病診斷治療的管控均具有重要的意義。本實驗采用LC-MS/MS定量分析方法，測定CRC小鼠血清和結腸組織中BAs的含量變化情況，考察VD對BAs的調控作用，為臨床診斷治療提供參考價值。

Fig 3 Effects of vitamin D on bile acids in mouse

A:The concentrations of BAs in colon of control group; B:The concentrations of BAs in colon of CRC group; C:The concentrations of BAs in colon of CRC+VD group; D. The concentrations of total BAs in colon. (1:T-β-MCA;2:G-CA;3:CA;4:G-DCA;5:T-CDCA;6:CDCA;7:G-LCA;8:T-LCA;9:LCA;10:α-MCA;11:G-UDCA;12:T-CA;13:T-DCA;14:DCA;15:β-MCA;16:T-UDCA;17:UDCA;18:G-CDCA;19:T-HDCA;20:HDCA).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCRC group.

Fig 4 Proportion of hydrophobic bile acids in

A:The concentrations of hydrophobic bile acids in serum; B:The concentrations of hydrophobic bile acids in colon;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCRC group.

研究表明，VD與CRC的高發密切相關，缺乏VD、高脂肪或低纖維素等飲食因素在CRC的發生發展中起著至關重要的作用，增加了CRC的發病率，Meta分析顯示，與具有低25(OH)D3水平的患者相比，具有高25(OH)D3水平的患者的結腸直腸癌風險降低30%～40%[11]。動物模型研究明確地表明VD的攝入能夠延緩化學誘導的低等級腫瘤前病變的形成，甚至阻止結腸高度發育不良的發展[12]。

Fig 5 Relative level of mRNA expression

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCRC group.

在本實驗中，除Control組外，利用AOM+DSS誘導的CRC模型，并分為CRC組和CRC+VD組。造模結束后對小鼠體重、結直腸長度的統計計算，并觀察小鼠結腸組織HE染色情況。CRC組的小鼠造模過程中體重下降，結直腸長度減少，HE染色提示結腸無腺體結構，包膜缺失且細胞增殖情況紊亂，而CRC+VD組則表現出一定的逆轉腸炎腸癌進展的表現，即結直腸長度呈現增加趨勢，鏡下觀察結腸腺體結構趨向正常。因此，可以初步得出結論，VD缺乏與CRC的高發密切相關，VD補充能夠抑制CRC的發生、發展。

BAs的穩態失衡是CRC發生發展重要誘導因素。動物研究發現在腸炎狀態下BAs選擇性的在結腸組織中蓄積是炎癥轉化為癌癥的重要環節[3]。本實驗結果表明，CRC小鼠的BAs內穩態顯著失衡，且在結腸處存在明顯的BAs蓄積，因此在腸炎腸癌狀態下BAs在結腸組織中蓄積是CRC發生發展的重要環節。VD已被證明在BAs代謝和CRC發展中都發揮重要作用。有文獻明確報道了活性VD治療可以刺激BAs代謝[13]。關于膳食VD的研究結果也進一步證明VD通過抑制限速酶CYP7A1的表達來抑制BAs合成[10]。FXR是一種核激素受體，可作為細胞內BAs水平的主要傳感器。從疏水性到親水性膽汁酸的等級順序對應于它們對FXR的親和力如下：LCA> DCA> CDCA> CA> UDCA> MCA[14]。在本實驗中，CRC組小鼠肝臟qPCR結果提示CRC小鼠FXR和CYP7A1的mRNA表達水平明顯升高，而當給予小鼠VD補充后，小鼠BAs水平明顯改善，肝臟mRNA水平逐漸趨于正常。因此，VD的補充可以減少BAs在結直腸的蓄積，從而抑制CRC的發生發展。

疏水性膽汁酸具有細胞毒性，長期的超生理濃度的疏水性膽汁酸暴露可以通過DNA氧化損傷、激活NF-κB、增加細胞增殖以及誘導凋亡抵抗而促進癌癥發生[15]。因此，長期暴露在較高的疏水性膽汁酸水平環境中是細胞癌變和CRC發生的重要環節。本實驗對小鼠結腸部位膽汁酸的測定中發現CRC組CDCA、LCA和DCA這些疏水性膽汁酸的含量顯著升高，而VD的補充能夠降低結腸組織中CDCA、DCA以及LCA的水平。結果表明，VD的補充能夠減少CRC狀態下疏水性膽汁酸的比例，降低疏水性膽汁酸對結直腸的毒性，進一步抑制CRC的發生發展。

綜上所述，CRC狀態下小鼠體內BAs穩態失衡，而VD可能通過調節體內疏水性膽汁酸的比例從而改善膽汁酸水平，調控了CRC的發生發展。