丹參莖葉酚酸組分對潰瘍性結腸炎模型小鼠的干預作用

彭珂毓，顧俊菲，宿樹蘭，朱 悅，郭建明，錢大瑋，段金廒

(南京中醫藥大學1.江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室、2.基礎醫學院中藥學教研室，江蘇 南京 210023)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是由宿主胃腸道微生物群落的異常免疫應答引起的慢性特發性疾病，是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的重要臨床亞型，其病因和發病機制不明。近年來，UC的發病率急劇上升且已不再局限于西方國家。在我國，隨著人們生活環境與方式的改變，UC的患病率逐年增加[1]。氨基水楊酸類、免疫抑制劑和糖皮質激素等為臨床治療UC的常用藥物，長期應用均具有不同程度的副作用[2]。丹參莖葉總酚酸具有保護糖尿病腎病、糖尿病腸病和改善心血管疾病等多種藥理活性[3-4]，其中丹酚酸類成分具有良好的抗炎活性，能夠修復腸屏障損傷，調節腸道微生物紊亂，增加腸道短鏈脂肪酸含量，達到對結腸炎的保護治療作用[5-6]。課題組前期研究發現，丹參莖葉中含豐富的酚酸類成分，尤以丹酚酸B和迷迭香酸為主，二者總含量與根中SAB和RA總含量相近，但兩者含量比例與根中不同。隨著丹參大宗產業不斷開發利用，帶來極大的經濟效益的同時，在生產過程中產生的大量未被利用的丹參莖、葉，也帶來了沉重的環境負擔和資源浪費，亟待尋找合理的丹參莖葉資源化利用途徑。

本研究采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導的UC小鼠模型，從綜合改善癥狀和降低炎癥反應方面研究丹參莖葉總酚酸及其所含丹酚酸B和迷迭香酸對UC模型小鼠的干預作用，以明確丹參莖葉抗UC的生物效應，為丹參莖葉的進一步開發利用提供科學依據。

1 材料及儀器

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6小鼠130只，♂，體質量(24±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2016-0003。

1.2 主要試劑柳氮磺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業有限公司，批號09170617)；丹參根總酚酸(西安小草植物科技有限責任公司，XC20170205)；丹酚酸B和迷迭香酸(南京春秋生物工程有限公司，DFSB20170915、MDXS20180521)，原兒茶醛和蘆丁(中國食品藥品檢定研究所，110810-201007、100080-201409)，丹參素、丹酚酸A、丹酚酸C、異槲皮苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷和紫云英苷(北京普天同創生物科技有限公司，MUST-13030108、MUST-13030701、MUST-15011305、MUST-15070211、MUST-16041507、MUST-13092006)，純度均大于98%；DSS(MPBIO公司，批號Q4299)；小鼠IL-6(貨號H007)、小鼠IL-4(貨號H005)、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α，貨號H052)試劑盒均購自南京建成生物有限公司。RNA逆轉錄試劑盒(Lot#N10227)和qPCR試劑盒(Lot#M31107)均購自TransGene公司。

1.3 儀器ACQUITY UPLC系統(Waters，美國)；ML204及MS-20S型分析天平(METTLER TLEDO，中國)；多功能酶標儀(PerkinElmer，美國)；ABI 7500實時定量PCR(Applied Biosystems，美國)；RM2016病理切片機(Leica，德國)；正置光學顯微鏡(Nikon，日本)。

2 方法

2.1 丹參莖葉總酚酸的制備丹參莖葉樣品于2018年7月采集于陜西銅川，60 ℃烘干除雜后，粉碎成粗粉(40目)。稱取丹參莖葉樣品400 g，參考文獻[7]提取方法制備得到丹參莖葉總酚酸，-30 ℃冰箱保存。

2.2 丹參莖葉總酚酸的成分分析

2.2.1色譜條件 采用UPLC對制備所得的丹參莖葉總酚酸和購買所得丹參根總酚酸進行含量測定。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)，流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，以0.4 mL·min-1的恒定流速進行梯度洗脫，進樣體積2 μL，柱溫35 ℃。洗脫條件為0～1 min，95%→95% A；1～3 min；95%→90% A；3～7 min，90%→85% A；7～11 min，85%→79% A；11～15 min，79%→67% A；15～17 min，67%→30% A；17～18 min，30%→20% A；18～20 min, 20%→20%；20～21 min，20%→95%)。酚酸類成分檢測波長為280 nm；黃酮類成分檢測波長為254 nm。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷及紫云英苷對照品適量，用90%甲醇配置成丹參素0.169 g·L-1、原兒茶醛0.245 g·L-1、迷迭香酸0.593 g·L-1、紫草酸0.127 g·L-1、丹酚酸B 0.271 g·L-1、丹酚酸A 0.138 g·L-1、丹酚酸C 0.103 g·L-1、蘆丁0.331 g·L-1、異槲皮苷0.147 g·L-1、山奈酚-3-O-蕓香糖苷0.218 g·L-1及紫云英苷0.217 g·L-1的混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸適量，加入90%甲醇，混勻，離心取上清液過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4線性關系、最低檢測限和最低定量限試驗 取混合對照品溶液，分別稀釋2、10、20、100、200倍進樣，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品的質量濃度為橫坐標(X)繪制各對照品標準曲線，線性回歸得各化學成分的回歸方程、相關系數及線性范圍。最低檢測限(limit of detection，LOD)和最低定量限(limits of quantification，LOQ)分別在各化合物的信噪比為3和10時測定。

2.2.5精密度、重復性和穩定性考察 精密度試驗：精密吸取混合對照品液連續進樣6次，計算各成分的峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。重復性試驗：精密稱取丹酚莖葉總酚酸適量，按“2.2.3”項條件平行制備6份供試品溶液進樣測定，計算各成分峰面積的RSD。穩定性試驗：取供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，計算各成分峰面積的RSD。

2.2.6加樣回收率考察 精密稱取丹酚莖葉總酚酸樣品粉末，分別加入一定量的丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷及紫云英苷對照品溶液，按“2.2.3”項條件下制備供試品溶液進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD。

2.3 藥物配制柳氮磺吡啶腸溶片研碎成粉末，以0.5%的羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na)混勻成濃度為50 kg·L-1。將丹參莖葉總酚酸、丹參根總酚酸、丹酚酸B及迷迭香酸均充分混勻于0.5%的CMC-Na溶液中，調整丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸濃度為20 kg·L-1，丹酚酸B和迷迭香酸濃度為6 kg·L-1。

2.4 動物造模及分組小鼠隨機分為13組：(1) 正常對照組(Control)；(2) 模型組(Model)；(3) 柳氮磺吡啶腸溶片組(SASP 500 mg·kg-1)；(4、5) 丹參莖葉總酚酸高、低劑量組(DYSAH 200 mg·kg-1、DYSAL100 mg·kg-1)；(6、7) 丹參根總酚酸高、低劑量組(DGSAH 200 mg·kg-1、DGSAL 100 mg·kg-1)；(8、9) 丹酚酸B高、低劑量組(SABH 60 mg·kg-1、SABL 30 mg·kg-1)；(10、11) 迷迭香酸高、低劑量組(RAH 60 mg·kg-1、RAL 30 mg·kg-1)；(12、13)丹酚酸B+迷迭香酸高、低劑量組(S+RH 120 mg·kg-1、S+RL 60 mg·kg-1)。除空白組給予不做任何特殊處理正常飲食飲水外，其余各組均飲用當日現配的2% DSS溶液連續7 d，造模成功后，按體質量10 mL·kg-1灌胃給藥7 d，共14 d。

2.5 標本采集給藥結束后，處死小鼠，迅速剖取結腸測定長度后，截取近直腸端1～2 cm放入4%多聚甲醛中固定過夜用于病理學分析，剩余組織馬上投入液氮速凍0.5 h后，放入-80 ℃冰箱保存。

2.6 疾病活動指數評分小鼠造模過程中，通過參考Cooper評分系統方法評定疾病活動指數(disease activity index，DAI)以量化結腸炎。具體評分標準如下：體重減輕的變化(0：0，1：1%～5%，2：5%～10%，3：10%～20%，4：>20%)；大便性狀(0：正常，1和2：稀便，3和4：腹瀉)；便血情況(0：陰性，1：+，2：++，3：+++，4：++++)；3項所得平均分即為DAI。

2.7 HE染色上述固定好的結腸標本，常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察病理損傷情況。

2.8 ELISA法測TNF-α、IL-6、IL-4水平取結腸組織，稱定重量，按比加入冰PBS溶液制成10%組織均漿液，離心后取上清液，按相應試劑盒操作說明進行測定。

2.9 實時熒光定量PCR測定IL-6、COX2、IL-17A mRNA表達取結腸組織，加入TRIzol及鋯珠冰上研磨提取總RNA，測定RNA純度。RNA逆轉錄試劑盒逆轉錄后，用qPCR試劑盒以20 μL反應體系進行PCR擴增。引物序列見Tab 1。以GAPDH為內參基因，采用相對定量法(2-ΔΔCt)得到目的基因相對表達量。

Tab 1 Primer sequences of genes

3 結果

3.1 丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸的成分分析結果比較

3.1.1方法學考察結果 各成分的回歸方程、線性范圍、LOD及LOQ結果如Tab 2所示。精密度試驗RSD在1.13%～1.57%，表明儀器精密度良好；重復性試驗RSD在2.41%～3.54%，表明方法重復性良好；穩定性試驗RSD在2.85%～3.95%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好；加樣回收率試驗回收率在98.1%～104.4%，RSD均小于2.76%。

3.1.2丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸的成分結果比較 對丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸進行成分分析，共確定了其中的11種酚酸黃酮類成分，詳見Tab 3。丹參莖葉總酚酸中主要含有水溶性酚酸類成分和少量黃酮類成分，含量分別為653.8 mg·g-1、18.67 mg·g-1；其中水溶性酚酸類以SAB和RA為主，含量比例接近1 ∶1。丹參根總酚酸主要含有水溶性酚酸類成分含量為780.8 mg·g-1，其中以SAB為主。

Tab 2 Linear regression, LOD and LOQ data

Tab 3 Contents of phenolic acids andflavonoids in DYSA and DGSA(mg·g-1)

3.2 丹參莖葉酚酸組分對DSS誘導的UC模型小鼠體重及DAI評分的影響重復測量方差分析結果顯示，正常對照組與模型組小鼠體重在7 d內，兩組間(F=75.40,P=0.00)及不同時間點間(F=45.23,P=0.00)差異均存在顯著性，并且存在明顯交互效應(F=90.56,P=0.00)，表明模型組小鼠體重雖受時間影響仍明顯低于正常對照組，見Tab 4。與模型組相比，各給藥組隨給藥治療時間延長小鼠體重緩慢增長，在d 6～d 7恢復明顯，各組間比較差異有顯著性(F=2.22,P=0.02;F=2.15,P=0.02)。各時間點間差異有顯著性(F=165.01,P=0.00)，并與組間存在明顯的交互效應(F=1.71,P=0.03)。將各給藥組與模型組比較得到SASP、DYSAL、SABH、SABL組間差異無顯著性，DYSAH、DGSAH、DGSAL、RAH、RAL、S+RH、S+RL組間差異有顯著性。對各組間進行簡單效應分析得到各組間不同時間點的差異；與模型組相比RAL體重在給藥d 2后即開始明顯回調(P<0.05)，S+RL在給藥d 3后即開始明顯回調(P<0.05)，結合體重均數趨勢發現RA與S+R比DYSA更有效，見Tab 5。模型組DAI評分在d 7內均明顯高于正常對照組(P<0.01)。給藥干預后，各給藥組小鼠在d 5～d 7水樣及稀便逐漸轉變成成形的松散軟便，便血癥狀基本消失，DAI明顯低于模型組(P<0.05)；其中DYSAH與RAH組DAI降低最為明顯(P<0.01)，見Tab 6。

Tab 4 Effect of DSS on weight of DSS-induced ulcerative n≥6)

##P<0.01vscontrol

Tab 5 Effect of DYSA, SAB and RA alone and in combination, on weight of UC

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 6 Effect of DYSA, SAB and RA alone and in combination on DAI score of UC

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig1RepresentativeHE-stainedcolonsections(×200,n=3)

3.3 丹參莖葉酚酸組分對DSS誘導的UC模型小鼠結腸組織病理形態的影響由Fig 1結果可知，與正常對照組相比，模型組小鼠結腸黏膜結構紊亂水腫，腸腺及隱窩大部分被破壞或消失，腸壁多處潰瘍或糜爛，伴有大量炎細胞浸潤，腸腔內可見許多壞死細胞。丹參莖葉酚酸組分給藥干預后腸道病理狀態得到不同程度的改善。DYSAH、DYSAL、RAL、S+RH和S+RL組較模型組小鼠結腸黏膜結構完整清楚，水腫及炎癥程度得到減輕，表現出明顯的保護干預作用。

3.4 丹參莖葉酚酸組分對DSS誘導的UC模型小鼠的結腸長度及TNF-α、IL-6和IL-4水平的影響模型組小鼠腸管長度明顯短于正常對照組(P<0.01)且IL-6、IL-4、TNF-α水平明顯高于正常對照組(P<0.01,P<0.05)。給藥干預后，各給藥組不同程度的改善結腸短縮及IL-6水平，對IL-4和TNF-α水平無明顯抑制作用。在各給藥組中，除DGSAH、DGSAL及SABH外其他給藥組結腸長度均明顯增長(P<0.05)，尤以DYSAL和S+RL組小鼠結腸平均長度最長，明顯長于模型組(P<0.01)。SABH組治療后IL-6水平明顯降低(P<0.01)，此外SASP、S+RL和RAL組治療后也明顯降低IL-6含量(P<0.05)，見Fig 2A～B、Fig 2C～E。

3.5 丹參莖葉酚酸組分對DSS誘導的UC模型小鼠結腸的炎性因子mRNA表達的影響與正常對照組相比，模型組小鼠結腸組織IL-6、COX2、IL-17A mRNA水平明顯升高(P<0.01)。給藥干預后，各給藥組均不同程度的降低COX2和IL-17A mRNA水平，其中DYSAH、SABH、RAL、S+RL組能明顯下調IL-6、COX2、IL-17A mRNA表達(P<0.05,P<0.01)。總體上，相比于DYSA，SAB和RA單獨或混合表現出對IL-6、COX2和IL-17A mRNA更為明顯的抑制作用，見Fig 3。

Fig 2 (A～B) Effect on colon length of UC mice;(C～E)Changes of IL-6,TNF-α and IL-4 levels in colon tissues of UC

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 討論

UC的復雜病因尚未完全明確，已知受損的腸上皮組織和活化的免疫細胞參與粘膜和粘膜下層炎癥相關細胞因子的持續過度產生及炎癥相關蛋白的上調(如COX2)從而導致細胞因子平衡紊亂是UC發病機制的重要原因[8]。COX2為一種常見的誘導酶，在病理狀態下誘導組織將花生四烯酸轉化為過量前列腺素，促使各種炎癥反應。文獻研究表明，UC的發病與COX2密切相關，并且病情越嚴重COX2表達水平越高[9]。對COX2的抑制可降低中性粒細胞浸潤，減輕炎癥反應，從而緩解UC的發生發展[10]。據報道，迷迭香酸能夠有效抑制NF-κB和STAT3的活化，降低促炎因子(TNF-α、IL-6等)及COX2的表達，減輕炎癥反應，改善DSS誘導的UC模型小鼠病理表現[5]。本研究發現，丹參莖葉總酚酸及其主要效應成分丹酚酸B和迷迭香酸對DSS誘導的UC模型小鼠結腸組織中COX2 mRNA均表現出抑制作用。

Fig 3 Changes of IL-6, COX2 and IL-17A mRNAin colon tissues of UC

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Lin等[11]發現，通過對STAT3依賴性的激活COX2轉錄，產生大量前列腺素可誘導Th17細胞分化。除此之外，IL-6在早期階段就可以協同TGF-β誘導Th17細胞。已經發現Th17細胞在IBD發展中的關鍵作用，是研究治療IBD的新方向[12]。UC患者腸道大量浸潤的Th17細胞主要表達IL-17A等，作用于中性粒細胞，刺激炎癥介質等分泌，加速中性粒細胞的募集、活化、遷移至病灶，進而加速炎癥進程和引起腸黏膜損傷[13-14]。主要含迷迭香酸的紫蘇提取物可抑制血清中IL-17A等的表達，達到對UC模型小鼠的保護作用[15]。本研究發現，迷迭香酸、丹酚酸B單獨或混合使用可明顯降低DSS誘導的UC模型小鼠結腸組織中的IL-6水平和IL-6、IL-17A mRNA表達；丹參莖葉總酚酸能夠降低IL-6含量，雖差異無顯著性，但能明顯抑制IL-6、IL-17A mRNA表達。

本文研究表明，丹參莖葉總酚酸及其主要效應成分丹酚酸B和迷迭香酸單獨或混合均不同程度的改善DSS誘導的UC模型小鼠的病理表現可能與下調IL-6蛋白及mRNA水平，抑制COX2、IL-17A mRNA表達，從而直接或間接影響IL-17A的分泌和Th17細胞的分化，緩解UC的發生發展，為丹參莖葉防治UC的進一步深入研究和丹參莖葉的開發利用提供了科學依據。