嬰幼兒配方粉中克羅諾桿菌檢測方法研究進展

王倩寧 劉艷梅 王弋博 王廷璞

摘要：近克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是一種新發現的食源性致病菌，能引起嬰幼兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結腸炎，致死率高.因此，建立準確、快速、有效的檢測方法已成為克羅諾桿菌研究的首要任務.闡述了克羅諾桿菌的分類和檢測研究進展，將傳統生化檢測、分子層面和免疫層面檢測方法進行匯總對比，為進一步優化克羅諾桿菌的檢測體系提供參考.

關鍵詞：克羅諾桿菌;檢測方法;研究進展

中圖分類號：TS207.4? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）02-0036-07

食品安全是一個重大的全球性公共衛生問題，由致病菌引起的食源性疾病是當前最主要的食品安全問題.克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是新發現的一種食源性致病菌，分布廣泛，在嬰幼兒乳制品、鮮蔬菜、谷類、調味料及肉制品等多種食品中均被檢出過[1]，該菌是一種條件性致病菌，致死率高達40-80%[2]，主要癥狀為嬰幼兒腦膜炎、菌血癥和小腸結腸炎等[3]，克羅諾桿菌被國際食品微生物標準化委員會列為“嚴重危害特定人群，危害生命或慢性實質性后遺癥或長期影響”的一種致病菌[4].目前還尚未確定克羅諾桿菌的宿主和傳播途徑，分析全球范圍內報道的嬰幼兒感染事件，表明嬰幼兒配方粉是該菌的主要感染源[5].因此，建立快速有效的檢測方法已成為克羅諾桿菌研究的主要內容之一.目前，國內外克羅諾桿菌的檢測方法主要有常規生化檢測方法、分子生物學檢測法和免疫學為基礎的檢測方法.此文旨在從分類和檢測方法兩個方向來闡述克羅諾桿菌的研究進展，為研究克羅諾桿菌的有效檢測方法提供更全面的參考.

1 克羅諾桿菌分類

克羅諾桿菌是一種寄生在人和動物腸道內，周身鞭毛、無芽孢的兼性厭氧型革蘭氏陰性菌.初名黃色陰溝腸桿菌，直到1980年，Farmer等[6]人對腸桿菌進行DNA雜交試驗，發現原黃色陰溝腸桿菌菌株之間DNA互補程度高達83-89%，與陰溝腸桿菌一致性僅為31-49%，結合生化反應、色素產物及抗生素敏感性等分析，Farmer等將其定義為腸桿菌屬的一個新種，并建議更名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）.隨著分子生物學技術的發展，Iverson等[7-8]根據16S rRNA基因序列特征、DNA雜交、核糖體分型以及擴增片段長度多態性熒光標記，對阪崎腸桿菌進行系統學分析，提議將該菌劃分為一個新屬——克羅諾桿菌屬（Cronobacter gen. nov）.該屬由1個新組合Cronobacter sakazakii;4個新種及l個基因種（Cronobacter genomospecies 1）組成.2012年Joseph等[9]對5株克羅諾桿菌的表型分型、7個管家基因的多位點序列進行分析和16S rRNA基因測序，發現了兩個新種，尤尼沃斯克羅諾桿菌（Cronobacter universalis）和康帝蒙提克羅諾桿菌（Cronobacter condimenti），其中尤尼沃斯克羅諾桿菌代替之前的基因種.目前，克羅諾桿菌屬包括7個種（見表1），和3個都柏林亞種（Cronobacter dublinensissubsp. Dublinensis），乳粉亞種（Cronobacter dublinensissubsp. Lactaridi）和洛桑亞種（Cronobacter dublinensissubsp. Lausannens）.

2 克羅諾桿菌的檢測方法

2.1 傳統生理生化檢測方法

克羅諾桿菌的傳統分離檢測方法，首先進行富集培養，再進行選擇性培養，經分離純化后得到目標菌株，此方法依據菌株形態學特點和生化鑒定結果進行檢測.

目前克羅諾桿菌主要的生理生化檢測方法有3種：美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）方法、阪崎腸桿菌顯色培養基（druggan-forsythe-iversen，DFI）方法和中國國家標準方法GB 4789.40-2016.

國際上首個官方檢測方法是美國FDA在2002年制定的“嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分離和計數”（此前名為阪崎腸桿菌）[10].檢測時，在無菌條件下每個奶粉樣品分別稱取100g、10g和1g各3份，以1∶10稀釋倍數進行稀釋，取10mL混合液接種到90mL無菌腸桿菌增殖（enterobacteria enrichment broth，EE）肉湯中，37℃孵育過夜;后取適量增菌液劃線于結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖培養基（violet red bile glucose agre，VRBGA）上，37℃過夜培養.挑取5個典型或疑似菌落劃線接種于大豆酪蛋白培養基（tryptose soya agar，TSA）上，25℃培養48-72h.用API 20E試劑條對TSA上的黃色菌落進行生化鑒定[11].該法需要7d左右的檢測時間，且有些克羅諾桿菌與某些腸桿菌科菌株的菌落形態和顏色在VRBGA培養基上差異小，挑取難度較高，存在誤檢和漏檢的風險.再者，有些克羅諾桿菌在TSA培養基上培養后菌體產生的黃色色素深淺不一，不易判定，也增加了誤檢和漏檢的風險.

Guillaume-Genti等[12]將FDA方法中的EE肉湯更換為10mg/L改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（modified lauryl sulfate tryptose vancomycin medium，mLST-Vm）.隨后的生理生化檢測研究中在該法的基礎上將選擇性培養基VRBGA改進為阪崎腸桿菌顯色培養基DFI，DFI培養基中加入了發色集團5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷（Xa-Glc），提高了檢測的特異性.國際標準微生物委員會以此方法為檢測嬰幼兒配方粉的技術規范，即ISO/TS 22964-2006“乳和乳制品中阪崎腸桿菌的檢測”[13].該方法用mLST-Vm和添加了顯色劑Xa-Glc的DFI瓊脂代替FDA方法中的EE肉湯和VRBGA，提高了阪崎腸桿菌的檢出率[14-15].中華人民共和國國家標準GB 4789.40-2016“克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗”中，以mLST-Vm和阪崎腸桿菌顯色培養基作為選擇性增菌和選擇性分離的培養基進行檢測.

2.2 分子生物學檢測法

常用的分子生物學檢測方法有普通聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法、實時定量PCR法和環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等.分子生物學檢測方法解決了傳統方法實驗操作繁瑣、檢測時間長等問題.

2.2.1 普通PCR

2003年Keyser等[16]以阪崎腸桿菌16S rRNA -23S rRNA區域序列（ITS）為分子靶點，首次建立了阪崎腸桿菌的快速PCR檢測方法.隨后Lehner等[17]發現Keyser制定的PCR檢測方法特異性不高，出現陰溝腸桿菌假陽性和莫金斯克羅諾桿菌假陰性的結果.針對這個問題，Lehner等研究克羅諾桿菌16S rRNA序列并建立進化樹，形成了特異性強、高靈敏度的PCR檢測系統，靈敏度高達10pg.

為了建立最適的阪崎腸桿菌PCR檢測方法.Nair等[18]通過克隆阪崎腸桿菌的外膜蛋白A（ompA）基因，建立了單重PCR快速檢測法，檢測結果顯示該方法對克羅諾桿菌的檢測具有良好的特異性.樓秀芹等[19]針對克羅諾桿菌ompA基因、16s rDNA和ITS序列進行多重PCR檢測，其結果與國家標準方法檢測的結果相一致.Stoop等[20]首次提出針對克羅諾桿菌屬特異性很強的rpoB基因序列設計引物進行檢測.Huang等[21]通過克隆DNA促旋酶B亞基基因，構建了僅能區別阪崎克羅諾桿菌和都柏林克羅諾桿菌的PCR檢測法.曲春波等[22]2013年首次利用編碼DNA促旋酶B亞基基因（拓撲異構酶型Ⅱ）的gyrB看家基因，設計了特異性引物，靈敏度達到1.41 pg/PCR，建立了克羅諾桿菌PCR快速檢測方法.可見普通PCR檢測靶點包括16s rDN、ITS序列、ompA基因、rpoB基因和DNA促旋酶B亞基基因等.

2.2.2 實時定量PCR

實時定量PCR（又稱熒光定量PCR），是一種核酸定量技術.在普通PCR檢測基礎上加入了熒光探針，把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起，依據熒光檢測信號的強弱來鑒定PCR產物，提高了檢測的靈敏度[23].

2005年Seo和Brackett[24]首次針對阪崎腸桿菌dnaG基因5'端和rpsU基因3'末端設計引物和Taq Man探針，構建實時定量PCR檢測方法.采用該體系鑒別克羅諾桿菌、腸桿菌和非腸桿菌科細菌，結果顯示此方法特異性強、準確度高，檢測靈敏度可達到0.6cfu/g.且檢測過程中省去平板接種和生化鑒定的時間，檢測效率遠高于傳統方法，作為FDA篩選和確認嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的官方方法之一.2012年Soler等[25]利用palF基因序列設計引物對多株克羅諾桿菌進行實時定量PCR檢測，準確度達到100%，特異性強，未發現非克羅諾桿菌的菌株，且樣品的檢測限可達到1 cfu/10g，靈敏度高.Wang等[26]2012年利用MMS操縱子基因序列對67株菌株（包括4株克羅諾桿菌）進行實時定量PCR檢測，檢出率為100%，靈敏度高，且不受高濃度沙門氏菌侵染的影響.采用此方法和ISO方法同時對92份食品樣品進行羅諾桿菌檢測，其陽性檢出率高于ISO方法.Dong等[27]和Hu等[28]分別針對ompA基因和cgcA基因設計探針引物，建立了比普通PCR靈敏度更高，特異性更強的檢測方法.近年來，也有許多關于多重熒光定量PCR用于鑒定克羅諾桿菌的報到.Li等[29]以16S rRNA和fusA基因進行引物設計，建立出能夠精確鑒別阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌的雙重熒光定量PCR方法，檢出限為102 cfu/mL.2016年Kaclíková和Oravcová利用dnaG基因建立了快速、準確地從嬰幼兒配方奶粉產品中檢測耐熱性克羅諾桿菌的熒光定量PCR方法[30].

2.2.3 環介導恒溫擴增技術

2000年Notomit等[31]建立了一種能在等溫條件下，短時間內進行核酸擴增的環介導恒溫擴增法.該技術能特異、高敏、高效地擴增目標基因，結果易判斷.

賀楠等[32]基于克羅諾桿菌16S rRNA基因設計LAMP引物，最低檢測限為0.3pg/DNA，靈敏度是普通PCR的1000倍.Liu等[33]和徐曉可等[34]探究了LAMP法和PCR法在克羅諾桿菌快速檢測中的差異性，研究結果一致表明LAMP法檢測的特異性和靈敏性明顯優于PCR法.

馬寅眾等[35]對克羅諾桿菌16S rRNA基因及外膜蛋白A（ompA）基因設計LAMP引物進行LAMP法檢測，ompA引物最低檢出限僅為16S rRNA引物的1/10.即以外膜蛋白A（ompA）基因設計LAMP引物靈敏度更高.

李靜等[36]在原有單引物環介導恒溫擴增技術的基礎上，以阪崎克羅諾桿菌ompA基因序列為靶序列，加入熒光染料，通過對熒光信號的分析，建立了一種操作簡單、耗時短、可實時監控的實時熒光單引物等溫擴增檢測阪崎克羅諾桿菌的方法.李麗麗等[37]針對克羅諾桿菌16S rRNA設計3組LAMP引物，建立的克羅諾桿菌恒溫實時熒光檢測法和傳統國標檢測結果一致，時效性高.

2.2.4 免疫學為基礎的檢測方法

免疫測定法（immunoassay，IA）是一種利用抗原和抗體特異性、可逆性為基礎的診斷方法，對細菌的鑒別研究，已有多半個世紀[38].現已建立的克羅諾桿菌免疫學檢測方法還不多.

2.2.4.1 免疫磁珠法（immunomagnetic separatio，MS）

免疫磁珠法是表面被抗體包被，進行抗原抗體特異性反應.在強大的外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細菌被滯留在磁場中，而其他沒有該種表面抗原的細菌不能與免疫磁珠相結合，從而達到分離的目的.這一技術目前已經廣泛運用于細胞分離、微生物檢測、蛋白質組學等方面也多有應用.

朱英蓮等[39]利用免疫磁性殼聚糖微球檢測克羅諾桿菌，將氨基化修飾后的磁珠與克羅諾桿菌抗體進行偶聯，捕獲并富集細菌.結果顯示該方法10.0min即可完成對克羅諾桿菌抗體的偶聯，捕獲率達94.7%，檢測結果與傳統培養法一致.說明免疫磁珠法是一種靶向特異性強、快速富集、分離克羅諾桿菌的有效方法.

Chen等[40]建立了一種免疫磁珠分離聯合熒光定量聚合酶鏈反應（immunomagnetic separation polymerase chain reaction，IMS-PCR）快速檢測克羅諾桿菌的方法，該法以免疫磁珠富集細菌，同時基于細菌外膜蛋白A（ompA）基因設計特異性引物，進行PCR檢測，經過8h富集后，檢出限從5.2×102cfu/mL降低至5.2×101cfu/mL.結果顯示IMS-PCR方法非常靈敏、快速、可靠.支援等[41]使用量子點熒光標記和免疫磁性分離聯合應用的檢測方法，檢測時間僅為2h，靈敏度高，特異性好，可應用于食品中的克羅桿菌檢測.

2.2.4.2 脂質體免疫檢測法（liposome immunoassay，LIA）

脂質體（Liposome）是脂類在水相介質中親水頭部插入水中，疏水尾部伸向空氣，自發形成的內部中空外層是雙層磷脂分子的球形小體[42]，直徑約為25～1000nm.由于脂質體表面能結合單克隆抗體或基因抗體，內部水相可嵌合大量顯色劑，使得所形成的免疫脂質體具有較高的靈敏度[43].

Song等[44]基于熒光脂質體結合免疫兔獲得抗穆汀斯克羅諾桿菌Ig G，制備熒光標記免疫脂質體，捕獲穆汀斯克羅諾桿菌，裂解后，在激發波長為550nm和發射波長585nm下測定熒光信號，結果顯示此方法靈敏度為6.3×104cfu/mL，相比傳統檢測方法具有快速、高效、低成本的優點.2016年Shukla等[45-46]人建立的阪崎克羅諾桿菌脂質體免疫檢測法靈敏度高于間接非競爭酶聯免疫吸附，且與克羅諾桿菌其他菌屬，以及其他非克羅諾桿菌無交叉反應.

2.2.4.3 酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）

酶聯免疫吸附法同樣以抗體和抗原的特異性結合為基礎，和其他免疫方法區別在于其以酶或者輔酶標記抗原或者抗體，將抗原抗體的特異性與酶促反應的敏感性相結合，提高檢測的靈敏性[47-48].采用ELISA技術，食品未經分離提取，即可進行定性和定量分析，顯著提高了檢出效率.目前，ELISA常用的方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法等，該技術由于靈敏度高、特異性強、攜帶方便、易于商品化和經濟實惠，在食品分析檢測方面前景廣闊.

宋春美等[49]和周鶴峰等[50]，建立雙抗夾心法檢測克羅諾桿菌，分別在6h和2h內得到檢測結果，檢出限均約在104cfu/mL，對其他食品中常見致病菌的檢測均呈陰性，無交叉反應靈敏度高.

Park等[51]2012建立了一種可在24h內針對穆汀斯克羅諾桿菌的雙抗夾心ELISA檢測法，該法最低檢出限為6.3×104cfu/mL，檢測靈敏度高，與克羅諾桿菌其他菌屬及其它常見致病菌間無交叉反應.Song等[52]利用間接非競爭性ELISA法建立了一種可同時檢測7種克羅諾桿菌的快速檢測方法，嬰幼兒奶粉中含克羅諾桿菌細胞數在10個以下的樣品，利用該方法可在36h內得到檢測結果，顯示出極高的靈敏性和特異性.

2.2.4.4 電化學免疫傳感器（Electrochemical? Immunosensor）

電化學免疫傳感器是將電化學傳感與免疫分析技術相結合而構建的一類新型生物傳感器，應用于痕量免疫原性物質的分析研究，因其特異性高、快速、穩定性強、造價低且操作程序簡易，在食品安全領域已有較多的研究和初步應用[53].

張曉等[54]依次將生物染料硫堇、辣根過氧化物酶標記的克羅諾阪崎腸桿菌抗體固定在用多壁碳納米管/十二烷基苯磺酸鈉修飾的四通道絲網印刷電極上，制成電化學免疫傳感器.該方法檢測阪崎克羅諾桿菌的線性范圍為102-108cfu/mL，檢出限為5.7×101cfu/mL，靈敏度很高，同時表現出較好的特異性和重現性（RSD=6.3%）.Shukla等[55]2018年使用氧化石墨烯納米金離子復合物建立免疫傳感器用于快速檢測阪崎克羅諾桿菌.每個樣品的分析時間只需要15min，無須任何富集或預富集，線性范圍為2.0×102-2.0×107cfu/mL，檢出限為2.0×101cfu/mL.與其他類型的克羅諾桿菌相比，此方法對阪崎克羅諾桿菌具有良好的選擇性、再現性和反應性.表明其在阪崎克羅諾桿菌臨床診斷中的具有潛在應用價值.

3 展望

克羅諾桿菌能引起新生兒致命傷害，而受到世界多國的高度關注，因此建立相關的有效檢測方法極為重要.目前已逐步建立了克羅諾桿菌的傳統生理生化檢測、分子層面和免疫等層面的檢測方法，其中傳統生理生化檢測不需要特殊的設備和技能，是食品安全國家標準選用的方法，也是各個質檢部門的首選方法，缺點是耗時、費力;為適應食源性致病菌的快速檢測，分子檢測和免疫檢測方法應運而生，分子檢測方法靈敏度高、時效性好，且引物的擴增是在完全封閉狀態下進行，避免了產物的污染，但分子層面的檢測依賴基因的特異性，尋找特異性顯著、可靠的基因片段，是以后的發展方向;抗體層面的檢測基于抗原和抗體特異性結合，靶向特異性強、靈敏度高、簡單、快速，成為近些年的研究熱點.

綜上所述，建立特異性好、敏感度高、簡單經濟、重現性高的克羅諾桿菌檢測方法有待于進一步的研究.隨著克羅諾桿菌屬菌株基因數據庫的完善，免疫傳感器的性能的改善以及免疫檢測手段的改進，分子層面、抗體層面及電化學相結合的檢測方法將成為克羅諾桿菌檢測的發展趨勢.

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