大鼠頸總動脈球囊拉傷模型的制作研究*

王 威 張穎倩 李中軒 周 瑾 陳韻岱

(1. 解放軍總醫院第一醫學中心心內科，北京 100853)(2.解放軍總醫院第七醫學中心心內科，北京 100700)(3.解放軍總醫院第八醫學中心衛勤部，北京 100094)

經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)是改善冠脈缺血的重要手段，但球囊擴張、支架置入等介入操作會對血管內壁產生機械損傷，影響內皮細胞層的完整性和內皮功能，這是PCI術后支架內再狹窄(in-stent restenosis, ISR)和支架內血栓形成的病理基礎，使得介入治療的遠期效果明顯受限。大鼠頸總動脈球囊拉傷模型是目前應用最廣泛的ISR動物模型，經皮冠狀動脈腔內成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)球囊導管是制作模型的關鍵用具，目前的研究對體質量區間在200～400 g的大鼠多采用直徑2.0 mm的球囊導管進行模型制作[1-3]。為進一步提高造模效率，我們試用更小口徑的球囊導管(1.5 mm)制作模型，以期探索出一種更穩定更高效的模型制作方法，為ISR的病理生理研究以及進一步的治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康成年雄性SD大鼠25只，體質量300～350 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006。本研究所涉及的所有動物實驗均符合相關規定與倫理學要求，實驗方案得到了中國人民解放軍總醫院實驗動物福利倫理委員會的批準，嚴格按照國家質量監督檢驗檢疫總局、國家標準委2018年發布的《實驗動物福利倫理審查指南》相關倫理原則以及中國人民解放軍總醫院實驗動物福利倫理委員會之動物實驗倫理及動物福利相關規定執行。

1.2 實驗儀器

2.0 mm×15 mm PTCA球囊導管(美國Cordis公司)，1.5 mm×15 mm PTCA球囊導管(美國Cordis公司)，顯微手術器械(動脈夾、眼科剪、鑷子、玻璃分針、手術縫合針線等)。

1.3 實驗試劑

0.5%伊文氏藍(中國Coolaber公司)，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffered Saline, PBS)(美國HyClone公司)，戊巴比妥鈉(德國merck公司)，丁丙諾啡(天津藥物研究院藥業有限公司)。

1.4 方法

1.4.1實驗動物分組:將25只大鼠隨機分為假手術組3只，大球囊組11只、小球囊組11只，大球囊組應用2.0 mm×15 mm PTCA球囊導管進行模型制作，小球囊組應用1.5 mm×15 mm PTCA球囊導管進行模型制作。假手術組僅做頸外動脈分離、切開，未行球囊導管插入。所有模型制作由同一操作者在1周內完成，應用不同型號球囊的模型制作交替進行。大球囊組、小球囊組兩組在體質量、數量上均無統計學差異。

1.4.2大鼠頸總動脈球囊拉傷模型的制作:SD大鼠禁食8 h，稱體質量，腹腔注射4%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，仰臥位固定，頸部備皮、75%酒精消毒，于頸部正中自下頜至胸骨柄上緣經皮做一直切口，鈍性縱向分離腺樣體、胸骨舌骨肌和右側胸骨乳突肌，暴露右側頸總動脈，沿右側頸總動脈向遠心端游離至頸總動脈的“Y”型分叉狀結構(頸總動脈上行至這里分為頸內動脈和頸外動脈)，暴露頸內動脈和頸外動脈。4-0絲線臨時結扎頸內動脈和頸外動脈遠心端，動脈夾夾閉頸總動脈近心端，在頸外動脈遠心端結扎處與頸總動脈“Y”型分叉口之間用眼科剪在頸外動脈做一切口，將球囊導管(大球囊組2.0 mm×15 mm，小球囊組1.5 mm×15 mm)自切口插入頸外動脈，打開動脈夾，將球囊導管進一步插入至頸總動脈根部(共插入約3 cm)，均以1.0個大氣壓將球囊充盈，緩慢拉回球囊至“Y”型分叉，將球囊抽真空，并再次插入至頸總動脈根部，然后再次充盈、拉回，反復3次，每次插入前旋轉球囊120°。3次拉傷完畢后撤出球囊并在“Y”型分叉處結扎頸外動脈，解開頸內動脈臨時結扎處，恢復頸總動脈、頸內動脈血流，確認頸總動脈搏動良好、血流通暢，逐層縫合頸部切口。術后予丁丙諾啡(0.05 mg/kg，皮下注射，2次/d，連續用藥3 d)止痛。飼養14 d，喂養用水和飼料為清潔水和標準飼料。

1.4.3伊凡氏藍染色驗證模型：將各組存活的大鼠在造模手術14 d后稱體質量，腹腔注射4%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，股靜脈注射0.5%伊文氏藍1 mL/100 g，30 min后，手術取材右側頸總動脈(剪取無名動脈發出段到“Y”型分叉段)，取材后動物在麻醉狀態下放血處死。右側頸總動脈用PBS洗滌后沿長軸縱向剖開、鋪平，觀察可見球囊拉傷之非內皮化區域為伊文氏藍染色呈藍色，內皮化區域無法藍染而呈白色。采集圖像并通過ImageJ 1.52a軟件計算藍色區域面積與總面積的比值。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 造模成功率比較

大球囊組11例，回拉球囊時頸總動脈斷裂致術中死亡3例，插管困難出血過多致術中死亡3例，最終造模成功5例(成功率45.5%，5/11)。小球囊組11例，插管困難出血過多致術中死亡1例，最終造模成功10例(成功率90.9%，1/11)。見表1。

表1 兩組頸總動脈球囊拉傷模型制作情況比較Table 1 The successful establish rate of carotid artery balloon-injured model in two groups

2.2 兩組內膜損傷面積占比的比較

球囊拉傷之非內皮化區域為伊文氏藍染色呈藍色，內皮化區域無法藍染而呈白色(圖1)。大球囊組藍色區域面積與總面積的比值平均值為0.56，標準差為0.18。小球囊組藍色區域面積與總面積的比值平均值為0.50，標準差為0.13。兩組比較無統計學差異，t=0.823，P=0.426。

圖1 兩組內皮損傷面積比較(伊凡氏藍染色)Fig.1 The area of injured endothelium in two groups (Ivans’ blue staining)

3 討論

經皮冠狀動脈介入治療是治療冠心病最有效的手段之一，但介入操作中的支架置入和球囊擴張產生的摩擦、壓迫等機械損傷以及隨之而來的局部血流的渦流、震蕩流均會影響血管內皮的功能和完整性[4-5]。血管內皮由具有抗凝、抗炎、調節血管張力、保持血管通暢等作用的單層內皮細胞構成的一層完整結構[6]。內皮的損傷和再內皮化的延遲是PCI術后出現支架內血栓等并發癥的重要原因，限制了PCI術的臨床效果，而且支架血栓的發生并沒有因新一代藥物涂層支架的應用而得到改善[7- 8]。加速再內皮化、修復內皮完整性、改善內皮功能是降低支架術后并發癥風險的重要靶點[9]。為進一步研究這些問題，最常用的動物模型就是大鼠頸總動脈球囊拉傷模型。近年來大多數研究中，行頸總動脈球囊拉傷模型制作的大鼠體質量常在200～400 g，而相應造模的球囊常選用2.0 mm甚至2.5 mm的球囊導管[10-13]。使用2.0 mm的球囊導管進行模型制作，在將導管插入頸總動脈后，以1.0～2.0個大氣壓充盈球囊、拉回導管時，常常產生很大阻力，若拉回導管速度過快則易造成動脈離斷，若速度過慢又延長了動脈血流阻斷的時間，增加了動脈血栓形成等造模失敗的風險。近年來，有學者嘗試在體質量600 g的雄性SD大鼠中使用1.5 mm的球囊導管和體質量350～400 g的雄性SD大鼠中使用1.25 mm的球囊導管進行模型制作并獲得成功[14-16]。為進一步驗證使用小口徑球囊導管進行模型制作能否提高造模成功率并取得與大口徑球囊導管一樣的動脈內膜損傷效果，我們設計了本研究。在研究中，我們在相近體質量300～350 g的大鼠中分別應用了1.5 mm和2.0 mm的球囊導管，研究發現小口徑的球囊導管可以顯著提高造模的成功率，且可以實現與大口徑球囊導管無明顯差異的動脈內膜損傷效果，為再內皮化的相關動物實驗研究提供了一種更為高效可靠的模型制作方法。