耳聾基因突變檢測國家參考品的研制

于婷 孫楠 曲守方 黃杰

分子流行病學調查顯示，在我國最常見的四個耳聾基因是GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和線粒體12S rRNA基因。GJB2基因是中國人群中常見的非綜合征性耳聾致病基因，其中235delC是GJB 2基因常見的突變形式。GJB 3基因突變可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳性非綜合征型耳聾。SLC26A4基因上IVS7-2A＞G突變是中國人大前庭水管綜合征中的熱點突變。線粒體上的1555A＞G突變與氨基糖甙類抗生素所致的聽力下降密切相關。臨床上采用聽力篩查與基因檢測相結合的方法[1]，有助于早期發現耳聾型高?；颊?，通過及時干預與治療以降低高危人群的發病率。

目前在臨床上，耳聾基因突變檢測的應用已經越來越普遍，并且隨著二胎計劃及國人對優生優育認識程度的增加，該檢測項目將會在更大范圍推廣應用。由于現有耳聾基因檢測試劑盒的檢測方法多種，包括微陣列芯片法、飛行時間質譜法、聯合探針錨定聚合測序法、熒光PCR法等，如何評價這類試劑盒的性能指標，保障臨床樣本檢測結果的準確性、有效性。采用耳聾基因突變參考品進行驗證是一個比較直接的辦法。中國食品藥品檢定研究院2016年起開始研制耳聾基因突變檢測性能評估的國家參考品，涵蓋上述4個耳聾基因20個堿基位點，為相關試劑盒的注冊檢測及臨床檢驗室間質評等提供可靠的參考品。

1 材料與方法

1.1 樣本

血樣來自濟寧婦幼保健院、天津華大臨檢中心、紹興市婦幼保院、北京301醫院和臺州醫院。

1.2 驗證試劑

十五項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒（微陣列芯片法）購自北京博奧生物有限公司；二十項遺傳性耳聾基因突變檢測試劑盒（飛行時間質譜法）購自廣州市達瑞生物技術股份有限公司；耳聾基因突變檢測試劑盒（聯合探針錨定聚合測序法）購自華大生物科技（武漢）有限公司；耳聾易感基因檢測試劑盒（PCR+導流雜交法）購自潮州凱普生物化學有限公司；先天性耳聾基因檢測試劑盒（熒光PCR法）、藥物性耳聾基因檢測試劑盒（熒光PCR法）和PDS基因檢測試劑盒（熒光PCR法）均購自濟南英盛生物技術有限公司；4項耳聾基因檢測試劑盒（ARMS-PCR法）購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 主要檢測儀器

晶芯?LuxScan?10K-B微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物有限公司生產并提供）、DR MassARRAY飛行時間質譜檢測系統（廣州市達瑞生物技術股份有限公司生產并提供）、BGISEQ-500基因測序儀（華大生物科技（武漢）有限公司生產并提供）、HB 2012A導流雜交儀（潮州凱普生物化學有限公司生產并提供）、ABI 7300熒光PCR儀（美國ABI生產，濟南英盛生物技術有限公司提供）、Bio-Rad S1000PCR儀（美國Bio-Rad公司生產，中生北控生物科技股份有限公司提供）。

1.4 方法

1.4.1 樣本篩選及采集

根據目標檢測的4個基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12SrRNA）的20個位點（GJB2基因的c.235delC、299_300del AT、c.35delG、c.176_191del 16突變，GJB3基因的c.538 C＞T、c.547G＞A突變，SLC26A4基因上的IVS7-2A＞G、c.2168 A＞G、c.1174 A＞T、c.1229 C＞T、c.1226G＞A、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162 C＞T、c.281C＞T、c.589 G＞A、IVS15+5G＞A突變，及線粒體12S rRNA基因的1095T＞C、1494C＞T和1555A＞G突變）的序列設計了10對PCR擴增引物，對每個樣本進行PCR反應，將獲得的基因擴增片段進行Sanger測序。確認為野生型或突變類型后，按照臨床外周血采集方法，采用EDTA抗凝真空采血管采集滿足要求的外周血（30mL/人），于-80℃保存。本研究的臨床基本信息收集和臨床血樣的采集均獲得了患者或其家屬的同意，并簽署了知情同意書。

1.4.2 國家參考品制備

將含野生型或突變型耳聾基因的外周血樣本置于室溫融化后混勻，取50μL血液樣本滴加到903濾紙上，血液均勻擴散為圓形，形成血斑，自然晾干呈深褐色后，封裝入含有干燥劑的密封袋內，并貼上標簽?；靹蛉獣r應盡量輕柔，以減少溶血。每次僅制備一個樣本的干血片，以防樣本間混淆。樣本編號一一核對，干血片組裝為兩人復核，保證組裝正確。因部分耳聾基因突變樣本未收集到，暫時采用DNA樣本，用Tris緩沖液稀釋后進行分裝，25μL/支。

1.4.3 參考品驗證

采用6個廠家8個試劑盒對參考品進行耳聾基因突變位點的驗證，這些試劑包含6種檢測原理，各家檢測范圍不完全一致。根據各企業說明書要求，對每份樣本提取的DNA及稀釋至1ng/μL的DNA進行檢測，若1ng/μL濃度的DNA樣本未能檢出相關的突變位點，則按照企業說明書聲稱的檢測限濃度進行復測。對于檢測結果，要求應檢出試劑盒檢測范圍內的突變位點；檢測范圍外的突變位點結果應為野生型。

1.4.4 國家參考品穩定性和均勻性驗證

隨機取4套參考品，分別于37℃放置1、2、3、4周后，采用聯合探針錨定聚合測序法進行檢測，上述穩定性數據同時作為均勻性數據。

2 結果

2.1 參考品組成

共篩選出18個位點突變陽性的臨床樣本及3例陰性樣本（上述20個位點均為野生型）。因SLC26A4基因的1229位點（19號樣本）和線粒體1494位點（20號樣本）突變的陽性樣本未收集到，只能采用DNA樣本，用Tris緩沖液稀釋后進行分裝，25μL/支，最終形成23份/套的耳聾基因突變檢測國家參考品，具體樣本信息表詳見表1。

表1 耳聾基因突變檢測國家參考品樣本信息表Table1 The information list of the national reference material of detection of deafness gene mutations

2.2 國家參考品驗證結

對于試劑盒檢測范圍內的突變位點，大部分試劑盒均能檢出樣本的突變位點，但以下樣本，出現雙突變位點或三突變位點情況：P4，除已知突變位點外，多數試劑還檢出299_300del AT；P10、P11、P17，除已知突變位點外，多數試劑還檢出IVS7-2雜合突變；P19情況最復雜，各家結果不一，廠家1和廠家5-2除已知突變位點外，還檢出IVS7-2雜合突變，廠家2僅檢出已知突變，經其測序驗證無SLC26A4：IVS7-2A＞G。廠家3采用2種方法通過2次試驗，均檢出c.1229C＞T雜合突變，但IVS7-2A＞G位點在不同檢測濃度檢測結果不一致：采用測序法，P19樣本DNA原濃度未檢出，稀釋至1ng/μL后可檢出，詳見表2；當采用飛行時間質譜法，均出現IVS7-2突變堿基峰，但低于野生型峰。廠家4采用的是PCR+導流雜交法，檢出了3個位點突變情況，包括1229M雜合突變、IVS-M雜合突變以及299M雜合突變。廠家5-1、5-3以及廠家6，1229C＞T和IVS7-2A＞G均不在其檢測范圍內，均表現為野生型；對于P9、P14、P16，廠家4檢出了1555突變，但經測序驗證均無1555突變。

表2 廠家3采用測序法測定的P19樣本SLC26A4基因IVS7-2A＞G突變位點結果Table2 Results of IVS7-2A＞Gmutation site of SLC26A4 gene in P19 sample determined bymanufacturer 3 with sequencingmethod

對于不同檢測濃度樣本，大部分廠家的試劑均可檢出，僅廠家6在檢測1ng/μL濃度的參考品樣本時，部分未檢出，按照試劑盒的檢出限稀釋樣本至5ng/μL時，可檢出。

最終：本批次國家參考品協作驗證的全部結果匯總見下表3。

表3 耳聾基因突變檢測國家參考品驗證結果匯總表Table3 The summary of validation results for the national reference material of detection of deafness gene mutations

2.3 參考品穩定性結果

對37℃放置1、2、3、4周后的參考品進行檢測，結果顯示，該4套參考品的突變位點的檢測結果與該公司檢測正常保存樣本結果一致。后在使用過程中，將定期對該國家參考品進行期間核查及長期穩定性研究。

2.4 國家參考品各位點匯總及質量標準的確定

通過6個廠家8個試劑盒的驗證，最終確認耳聾基因突變檢測國家參考品中：N1～N3未檢測到以上20個突變位點。P4增加c.176_191del16位點缺失突變，P10、P11和P17增加IVS7-2A＞G位點突變，P20增加c.235delC缺失突變。各家對P19樣本中的IVS7-2A＞G位點檢測結果存在一定爭議，分析可能存在雜合突變或者樣本被污染。最終P19定為：若c.1229C＞T為試劑盒檢測范圍內的位點，可僅檢出該突變。不對IVS7-2 A＞G缺失突變作要求。此外，因P19和P20樣本未采集到血樣，采用的是DNA參考品，各家測定濃度差異較大。因此在實際檢測之前，需對兩樣本的DNA濃度進行測定，若濃度低于試劑盒聲稱的檢測限，允許檢測范圍內的位點檢測結果為野生型。

通過以上結果確認采用此套參考品的質量標準為：試劑盒檢測范圍內的位點應檢出；檢測范圍外的位點應為野生型。DNA參考品（P19和P20）濃度若低于試劑盒聲稱的檢測限，允許檢測范圍內的位點檢測結果為野生型。P19參考品，若1229 C＞T為試劑盒檢測范圍內的位點，可僅檢出該突變。

3 討論

耳聾是人類最常見的感覺缺陷型疾病之一。耳聾的致病因素主要有環境因素、遺傳因素，或二者共同存在，據報道有超過65%的耳聾是由遺傳缺陷引起的[2-5]。我國每年新增約30000例先天性耳聾患兒[6]。大部分為重度、極重度感音神經性耳聾，這嚴重影響了患者的交流和認知能力，也對個人、家庭及社會造成了巨大的經濟和生活負擔，所以耳聾早期診斷、早期干預和早期治療的工作非常重要。

目前已有注冊證的各類耳聾基因突變檢測試劑盒有多種[7-12]，因其方法原理不盡相同，試劑盒的準確性、特異性、檢測限等性能必然有所差異，這些差異會不會對臨床結果有影響？有效評價方法之一，就是建立耳聾基因突變檢測參考品。根據《醫療器械監督管理條例》《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）精神，將“組織體外診斷試劑國家標準品、參考品的制備和標定工作”的責任主體明確為中檢院，以及參考上述研究背景，我院開展了耳聾基因突變檢測國家參考品的研制工作。通過分子流行病學調研，采集了我國最常見的耳聾基因為GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和線粒體12S rRNA基因相關突變位點陽性的外周血，制備成國家標準品。6個廠家8個試劑盒的協作驗證，大部分參考品的各突變位點均能被檢出，而且部分參考品還檢出了新的突變位點。一方面表明國家標準品適用性良好，另一方面，新突變位點的檢出應是受限于所選用的方法和現有的認識，在研制的時候，不一定能完全給出其全部突變位點信息，通過協作驗證，使得參考品的突變位點信息更為完善。驗證過程中，也發現存在一些問題，某檢測試劑在多個參考品中檢出了12SrRNA的1555A＞G位點的突變，而測序結果表明無該位點突變。這就需要該檢測試劑廠家主動找原因進行分析，是試驗過程中污染還是試劑設計問題？對于3個陰性樣本（N1～N3），限于目前技術原因和認識水平，目前只確認此20個突變基因位點為野生型，但不排除有其他突變基因位點存在，這個將隨著參考品在實際應用過程中及時進行更新。

從DNA測序技術應用在遺傳性耳聾的分子病因檢測以來，已經發現超過220個耳聾基因[13]，而且最新的遺傳信息學表明，與遺傳性聾相關的基因達300～500個[14]。但多數相關基因突變所致的發病率并不高，因此要制備數量如此多的以全血為基質的耳聾基因國家參考品盤，必然是一個耗時和昂貴的工程。但就目前來說，這套國家參考品突變位點雖僅為20個常見突變位點，但也基本涵蓋了市場上所有具有注冊證的耳聾基因突變檢測試劑盒所檢測的突變位點類型，可以滿足評價現階段各試劑盒基本性能的要求，并且將在今后根據需要逐步擴充新的耳聾基因突變位點。這套參考品必將為我國耳聾的早期防治工作發揮重要的作用。