TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ在POP患者子宮主韌帶組織中的表達(dá)及意義

張凱 薛惠英 張雪芹

流行病學(xué)研究證實(shí)，盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）的發(fā)病率可超過473～684/1萬女性左右[1]。臨床上POP的發(fā)生，能夠?qū)е伦訉m脫垂、陰道前后壁脫垂及壓力性尿失禁的發(fā)生，導(dǎo)致女性患者生活質(zhì)量的顯著下降[2]。

對(duì)于POP的病因探討具有重要的意義，其能夠深入揭示POP的發(fā)病機(jī)制，從而為疾病的預(yù)防提供理論參考。生物學(xué)因子指標(biāo)的表達(dá)，能夠通過影響到盆腔內(nèi)韌帶的張力、纖維組織的順應(yīng)性及膠原纖維的修復(fù)，進(jìn)而參與到女性POP的發(fā)生過程。轉(zhuǎn)化生長因子-1（Transforming growth factor，TGF-β1）能夠促進(jìn)盆地纖維細(xì)胞的損傷修復(fù)，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增生，提高盆底組織的抗張力和抗機(jī)械性應(yīng)力的能力[3]；基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）的表達(dá)，能夠通過促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)成分蛋白酶的激活，促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)的分解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)成分中膠原成分的降解，導(dǎo)致盆底臟器組織脫垂風(fēng)險(xiǎn)的上升[4]；膠原蛋白Ⅲ型（CollagenⅢ）的表達(dá)濃度的上升能夠降低韌帶組織的韌性，提高韌帶組織對(duì)于子宮及陰道前后壁的支撐能力，增加組織的抗張力強(qiáng)度[5]。為了揭示TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的表達(dá)與POP的關(guān)系，從而為臨床上POP的診療提供理論方面的參考，本次研究搜集POP患者45例，探討了TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ在主韌帶組織中的表達(dá)情況，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年5月在本院治療的POP患者45例（POP組），其中Ⅲ期25例，Ⅳ期20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合盆腔器官脫垂定量分期法（Quantitative staging of pelvic organ prolapse，POP-Q）中的Ⅲ和Ⅳ期患者；②經(jīng)尿動(dòng)力檢查無尿失禁；③在我院行手術(shù)治療；④術(shù)后病理證實(shí)為非子宮內(nèi)膜異位癥等雌激素相關(guān)疾病；⑤患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有松皮病、肺氣腫等彈性纖維異常疾病；②有生殖道、泌尿系統(tǒng)感染；③近期3個(gè)月服用過激素類藥物。同時(shí)選取因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變或良性腫瘤行子宮切除的無POP患者50例作為對(duì)照組，觀察組和對(duì)照組年齡、產(chǎn)次等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本次研究所有患者均知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組一般資料比較[n，（±s）]Table1 Comparison of basic data in 2 groups[n，（±s）]

表1 兩組一般資料比較[n，（±s）]Table1 Comparison of basic data in 2 groups[n，（±s）]

組別POP組對(duì)照組t/χ2 值P值n 4550年齡（歲）54.92±8.2955.10±9.100.1000.920產(chǎn)次1.78±0.471.70±0.500.8010.425體重指數(shù)（kg/m2）22.98±3.2023.01±3.110.0460.963絕經(jīng)情況絕經(jīng)前26 300.0480.826絕經(jīng)后19 20

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化法檢測(cè)TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的表達(dá)：采用石蠟包埋組織進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，8%的蛋白粉封閉液（商品名：BSA購自南京博奧生物科技公司），封閉2 h，倒去封閉液后加入TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ一抗（兔來源 濃度1∶1000～1500其中TGFβ1、MMP-3抗體購自abcam公司，CollagenⅢ抗體購自上海泰康生物公司），4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入二抗（鼠來源1∶400～500購自南京博奧生物公司），室溫孵育20～30min，沖洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標(biāo)記物，室溫孵育10min，沖洗3次，每次3～5min，滴加顯色劑（DAB購自南京博奧生物科技公司），復(fù)染，脫水，封片。

讀片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；②根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%為1分、陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分、陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽性細(xì)胞數(shù)所占比例＞75%為4分，兩種積分相乘總分＜3分為陰性、≥3分為陽性。

Western blot檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)灰度值：將所研磨的子宮韌帶組織蛋白與上樣緩沖液以5∶1的濃度相互混合，80～100℃煮沸5min。根據(jù)不同的蛋白分子量水平，配制并灌注相應(yīng)的12%的分離膠和5%的濃縮膠，按15g/孔蛋白量進(jìn)行組織蛋白的上樣，進(jìn)行SDS.PAGE電泳，電泳后根據(jù)條帶進(jìn)行切膠，半濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，BSA蛋白封閉2h，加入含10%BSA一抗及二抗（1∶1000），磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5min，采用儀器讀取平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件，計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 POP組和對(duì)照組TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)比較

POP組TGF-β1和CollagenⅢ陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而MMP-3陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2，POP組TGF-β1和CollagenⅢ表達(dá)平均灰度值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而MMP-3平均灰度值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的陽性著色均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，見圖1。

表2 POP組和對(duì)照組TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ性表達(dá)情況比較[n（%）]Table2 Comparison of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢpositive expression between pop group and controlgroup[n（%）]

表3 POP組和對(duì)照組TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)灰度值比較Table3 Comparison of expression gray values of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢbetween pop group and controlgroup

圖1 各組子宮主韌帶組織中TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)免疫組化圖Figure1 expression of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin themain ligament of uterus of each group

2.2 POP組絕經(jīng)前及絕經(jīng)后TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)比較

POP組絕經(jīng)后患者TGF-β1和CollagenⅢ陽性表達(dá)率明顯低于絕經(jīng)前患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而MMP-3陽性表達(dá)率明顯高于絕經(jīng)前患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 POP組絕經(jīng)前及絕經(jīng)后TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ陽性表達(dá)率比較[n（%）]Table4 Comparison of the expression of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin the pop group before and aftermenopause[n（%）]

POP組絕經(jīng)后患者TGF-β1和CollagenⅢ表達(dá)平均灰度值明顯低于絕經(jīng)前患者，而MMP-3平均灰度值明顯高于絕經(jīng)前患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 POP組絕經(jīng)前及絕經(jīng)后TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)灰度值比較[n（%）]Table5 Comparison of expression gray values of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin pop group before and after menopause[n（%）]

2.3 POP組不同分期患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)比較

POP組Ⅳ期患者TGF-β1和CollagenⅢ陽性表達(dá)率明顯低于Ⅲ期患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而MMP-3陽性表達(dá)率明顯高于Ⅲ期患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6。POP組Ⅳ期患者TGF-β1和CollagenⅢ表達(dá)平均灰度值明顯低于Ⅲ期患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而MMP-3平均灰度值明顯高于Ⅲ期患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表7。

表6 POP組不同分期患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ陽性率比較[n（%）]Table6 Comparison of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢexpression in differentstages of pop group[n（%）]

表7 POP組不同分期患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)灰度值比較[n（%）]Table7 Comparison of expression gray values of TGF-β1，MMP-3and collagenⅢin pop group atdifferentstages[n（%）]

2.4 相關(guān)分析

將POP患者TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ表達(dá)灰度值進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：TGF-β1、CollagenⅢ與MMP-3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.563，-0.677；P＜0.05），TGF-β1與CollagenⅢ呈正相關(guān)（r=0.441，P＜0.05）。

3 討論

子宮主韌帶是維持子宮盆腔內(nèi)臟器位置，支持子宮及陰道前后壁解剖結(jié)構(gòu)的重要韌帶，子宮主韌帶張力的下降或者韌帶組織的松弛，能夠顯著促進(jìn)POP的發(fā)生，導(dǎo)致子宮脫垂和陰道前后壁脫垂的發(fā)生。不同的生物學(xué)機(jī)制，均能夠促進(jìn)子宮主韌帶張力和抗機(jī)械性應(yīng)力能力的改變，導(dǎo)致韌帶彈性的下降。TGF-β1是生長因子家族成員，其能夠通過促進(jìn)韌帶間質(zhì)細(xì)胞的增生和修復(fù)，提高韌帶的纖維細(xì)胞密度，改善韌帶的彈性和張力；MMP-3是金屬基質(zhì)蛋白酶超家族成員，其能夠參與到炎癥、自身免疫性疾病或者惡性腫瘤的發(fā)生過程，其表達(dá)濃度的上升能夠促進(jìn)主韌帶間質(zhì)細(xì)胞的分解，導(dǎo)致膠原細(xì)胞含量的減少，膠原密度的下降，從而促進(jìn)了臟器脫垂的發(fā)生[9]；CollagenⅢ是維持盆底支持結(jié)構(gòu)的重要細(xì)胞間質(zhì)成分，其能夠穩(wěn)定膠原纖維的張力，提高子宮主韌帶的順應(yīng)性[10]。

本次研究發(fā)現(xiàn)在子宮主韌帶組織中，TGF-β1、CollagenⅢ的表達(dá)陽性率及平均灰度值均較未脫垂的女性明顯下降，而MMP-3的表達(dá)陽性率及平均灰度值則明顯上升，提示了TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的表達(dá)異常均能夠參與到POP的發(fā)生發(fā)展過程。這主要由于TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ的病理性作用有關(guān)[11-12]：①TGF-β1或者CollagenⅢ的下降，能夠?qū)е伦訉m主韌帶間質(zhì)細(xì)胞成分中膠原蛋白Ⅳ、Ⅵ及Ⅷ新生能力的不足，導(dǎo)致膠原蛋白抗張力能力的下降；②MMP-3的上升，能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白酶的激活，促進(jìn)膠原蛋白的分解，導(dǎo)致主韌帶組織中膠原厚度和數(shù)量的減少，從而促進(jìn)了POP的發(fā)生[13]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、MMP-3及CollagenⅢ等主要表達(dá)于子宮韌帶組織細(xì)胞質(zhì)中，推測(cè)相關(guān)指標(biāo)主要通過影響到韌帶組織細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的功能，進(jìn)而影響到了POP的病情進(jìn)展。在絕經(jīng)后的患者中，TGF-β1及CollagenⅢ的表達(dá)陽性率及平均灰度值明顯的下降，而MMP-3的表達(dá)陽性率及平均灰度值明顯的上升，提示絕經(jīng)對(duì)于POP女性主韌帶組織中不同生物學(xué)因子的影響，這主要由于絕經(jīng)后，體內(nèi)性激素水平的波動(dòng)，能夠降低主韌帶組織中膠原纖維的分化能力，抑制了TGF-β1及CollagenⅢ的合成。臨床分期較晚的患者，其TGF-β1及CollagenⅢ的表達(dá)陽性率及平均灰度值明顯下降，而MMP-3的表達(dá)陽性率及平均灰度值明顯上升，提示了相關(guān)因子與POP患者的病情嚴(yán)重程度之間存在一定的聯(lián)系，這主要由于脫垂情況越為嚴(yán)重，間質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)能力越低，TGF-β1越低，膠原蛋白的含量越少，CollagenⅢ也越少[14]。

本次研究的創(chuàng)新性在于揭示了POP患者主韌帶組織中TGF-β1、CollagenⅢ與MMP-3的表達(dá)與絕經(jīng)和臨床分期的關(guān)系。綜上所述，在POP患者中，TGF-β1、CollagenⅢ的表達(dá)明顯下降，MMP-3的表達(dá)明顯上升，同時(shí)在絕經(jīng)或者臨床分期較晚的患者中，相關(guān)因子的差異性表達(dá)更為明顯。