攜帶NDM-1基因合并膜孔蛋白OmpK36缺失肺炎克雷伯菌耐藥性分析

涂海健 黃亞雨 陳淑娟 許光輝

自從2009年Dongeun首例報(bào)道從印裔瑞士旅游者尿路感染標(biāo)本中分離出攜帶產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NewDelhimetallo-beta-lactamase 1，NDM-1）肺炎克雷伯菌，也被稱之“超級(jí)細(xì)菌”后，因產(chǎn)NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌對(duì)青霉素類，一至四代頭孢菌素、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等藥物高度的耐藥性已引起全球廣泛關(guān)注[1]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，NDM共17個(gè)基因突變體，主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、革蘭氏陰性非發(fā)酵菌、假單胞菌屬和鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶，NDM基因主要通過(guò)質(zhì)粒在細(xì)菌屬內(nèi)及屬間傳播[2-3]。我國(guó)多個(gè)城市都有產(chǎn)NDM型β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌報(bào)道，其中北京、上海、海口、廈門(mén)等一線和沿海城市陽(yáng)性率較高，且檢出攜帶NDM基因菌逐年升高的趨勢(shì)，產(chǎn)NDM型β-內(nèi)酰胺酶菌都是多重耐藥菌或?yàn)榉耗退幘鶾4]。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明產(chǎn)NDM型β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌已在全球范圍流行并引發(fā)多種類型感染，是威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2]，及時(shí)準(zhǔn)確了解產(chǎn)NDM型β-內(nèi)酰胺酶菌耐藥機(jī)制、流行現(xiàn)狀和特點(diǎn)，是預(yù)防和控制產(chǎn)NDM耐藥菌感染的關(guān)鍵所在。本文對(duì)從前列腺增生患者尿液標(biāo)本中分離出的1株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant klebsiella pneumoniae，CRKP），對(duì)其耐藥情況、分子多位點(diǎn)序列分型，攜帶耐藥基因、傳播方式，膜孔蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究，旨在了解本地區(qū)攜帶NDM-1基因肺炎克雷伯菌耐藥、分子流行特點(diǎn)及耐藥機(jī)制，為臨床抗菌治療和醫(yī)院內(nèi)感染控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

實(shí)驗(yàn)菌為2017年分離自莆田學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科前列腺增生患者尿液標(biāo)本中分離出1株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706、大腸桿菌J53購(gòu)置于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ATCC25922，ATCC13883標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)置于衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)檢驗(yàn)中心。

1.2 藥敏試驗(yàn)、EDTA協(xié)同試驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用法國(guó)梅里埃公司VITEK 2 compact系統(tǒng)及配套GN-13藥敏卡進(jìn)行藥敏MIC值檢測(cè)，對(duì)亞胺培南耐藥的菌株鑒定為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。EDTA協(xié)同試驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)按文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]進(jìn)行。

1.3 多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）檢測(cè)

按MLST website（http：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/m lst/Kpneumoniae.htm l）要求對(duì)肺炎克雷伯菌的7個(gè)保守官家基因（gapA，infB，mdh，pgi，phoE，rpoB和t on B）設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后上ABI 3730XL測(cè)序，結(jié)果用Polyphred軟件分析。

1.4 β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)耐藥基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因檢測(cè)

提取靶基因用PCR技術(shù)擴(kuò)增相關(guān)β-內(nèi)酰胺酶基因和膜孔蛋白Omp K35、Omp K36基因，引物如表2所示，擴(kuò)增后的產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂凝膠電泳后觀察結(jié)果。

表1 肺炎克雷伯菌的7個(gè)保守官家基因PCR及測(cè)序引物Table1 7PCR and sequencing primers for housekeeping genes of K lebsiella pneumoniae

表2 β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)耐藥基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因擴(kuò)增引物及片段Table2 Amplification primers and fragments of beta-lactamase-related drug resistance genes andmembrane porin OmpK35 and OmpK36 genes

1.5 NDM-1和OmpK35、OmpK36基因序列分析

取NDM-1和OmpK35、OmpK36基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行純化后用ABI3730XL進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在Genbank網(wǎng)站上進(jìn)行Bl as t分析。

1.6 采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)膜孔蛋白OmpK35、OmpK36

取20mL對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肉湯培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行超聲波破碎，采用超高速離心法提取膜蛋白，具體參數(shù)按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，取20μg含膜孔蛋白懸液上膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，最后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色并脫色后觀察結(jié)果。

1.7 質(zhì)粒接合試驗(yàn)

以產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌為供體菌，用耐疊氮鈉的大腸桿菌J53作為受體菌，各取0.5mL肉湯中培養(yǎng)的供體菌和受體菌混勻，后置于4 mL LB肉湯中35℃靜置過(guò)夜，取以上菌液涂布于含100μg/mL疊氮鈉和0.5μg/mL亞胺培南的MAC培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，對(duì)篩選出陽(yáng)性菌即接合子用紙片瓊脂擴(kuò)散法（Kirby-Bauer disc agar diffusion method，K-B）檢測(cè)3種碳青霉烯類藥物美羅培南、亞胺培南、厄他培南的抑菌大小以判斷其耐藥情況。美羅培南、亞胺培南、厄他培南藥敏紙片購(gòu)置英國(guó)Oxiod公司。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)NDM-1酶肺炎克雷伯菌耐藥情況及EDTA協(xié)同試驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果

產(chǎn)NDM-1酶肺炎克雷伯菌對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類藥物包含加酶抑制劑及碳青霉烯類藥物耐藥，合并對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物耐藥，表現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象具體見(jiàn)表3，EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽(yáng)性、改良Hodge試驗(yàn)陰性，見(jiàn)圖1。

圖1 改良Hodge試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果Figure1 Results of EDTA synergistic test and modified Hodge test

2.2 MLST基因分子分型結(jié)果

實(shí)驗(yàn)菌檢測(cè)出的等位基因譜為gapA，1；infB，1；mdh，1；pgi，1；phoE，1；rpoB，1；和tonB，1；故該株MLST基因分子分型為ST 15型。

表3 產(chǎn)NDM-1酶肺炎克雷伯菌耐藥情況及EDTA協(xié)同試驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果(μg/mL)Table3 Drug resistance of NDM-1-producing K lebsiella pneumoniae and results of EDTA synergistic testand modified Hodge test(μg/mL)

2.3 β-內(nèi)酰胺酶基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因檢測(cè)結(jié)果

該菌株P(guān)CR檢測(cè)出攜帶NDM-1、KPC及SHV基因，未檢測(cè)到VIM、IMP、OXA-48、GES、GIM基因；檢測(cè)出膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因。NDM-1陽(yáng)性結(jié)果，如圖2所示。

圖2 NDM-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure2 Electrophoresis results of NDM-1 gene amplified by PCR

2.4 NDM-1和OmpK35、OmpK36基因序列分析

PCR檢測(cè)NDM-1陽(yáng)性的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖3，序列通過(guò)NCBIblast比對(duì)確認(rèn)為目標(biāo)序列；OmpK35、OmpK36基因序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)存正點(diǎn)突變及片段缺失的現(xiàn)象。

圖3 NDM-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序確認(rèn)結(jié)果Figure3 The amplified products of NDM-1 gene by PCR were confirmed by sequencing

2.5 O mpK35、OmpK36膜孔蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

膜孔蛋白SDS-PAGE電泳顯示泳帶分子量在34 kDa和43kDa之間，對(duì)照組顯示兩條泳帶OmpK36（38.7kDa）及OmpAk（36.0kDa），而攜帶NDM-1基因菌株標(biāo)本只顯示一條泳帶OmpKA（36.0kDa），另一條Omp K36缺失，見(jiàn)圖4。

圖4 膜孔蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果Figure4 SDS-PAGE electrophoresis of membrane pore protein

2.6 質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)及接合子藥敏鑒定結(jié)果

對(duì)篩選出陽(yáng)性的大腸桿菌J53受體菌，用PCR擴(kuò)增驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)經(jīng)質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)后受體菌攜帶有NDM-1基因；并且其對(duì)3種碳青霉烯類藥物美羅培南、亞胺培南、厄他培南的抑菌圈分別縮小3.1（31/10）倍、2.3（28/12）倍、5.3（32/6）倍，見(jiàn)圖5。

圖5 大腸桿菌J53接合試驗(yàn)前后對(duì)碳青霉烯類藥抑菌比較Figure5 Comparison of bacteriostasis to carbapenems before and after conjugation test of Escherichia coli J53

3 討論

隨著碳青霉烯類藥物在臨床的普遍使用，細(xì)菌對(duì)其耐藥也日趨嚴(yán)重，目前認(rèn)為細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶是產(chǎn)生耐藥的主要原因[8]，碳青霉烯酶是一類能水解碳青霉烯類藥物的β-內(nèi)酰胺酶。NDM-1為含金屬的β-內(nèi)酰胺酶，因產(chǎn)生此酶的細(xì)菌表現(xiàn)為對(duì)抗生素高度耐藥，所以其一經(jīng)出現(xiàn)引起全球關(guān)注，給臨床抗感染提出嚴(yán)峻的考驗(yàn)。

現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外產(chǎn)NDM-1細(xì)菌的報(bào)道越來(lái)越多，甚至有暴發(fā)流行的報(bào)道[9-10]，本研究的菌種是從前列腺增生患者尿液標(biāo)本培養(yǎng)分離對(duì)亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌株，改良Hodge試驗(yàn)陰性，而EDTA協(xié)同實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性；雖然改良Hodge試驗(yàn)陰性，仍推測(cè)實(shí)驗(yàn)菌為產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的碳青霉烯類藥耐藥的肺炎克雷伯菌，有報(bào)道認(rèn)為改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶敏感度、特異性低的缺點(diǎn)，易出現(xiàn)假陰性[11-12]，本例改良Hodge試驗(yàn)陰性，可能也是該原因?qū)е隆＿M(jìn)一步采用PCR對(duì)相關(guān)β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該菌除攜帶NDM-1基因外還攜帶KPC、SHV基因，NDM-1的基因經(jīng)序列分析比對(duì)確認(rèn)，最終認(rèn)定實(shí)驗(yàn)菌產(chǎn)NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶。該菌株表現(xiàn)對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類藥物包含加酶抑制劑及碳青霉烯類藥物耐藥，僅對(duì)丁胺卡那霉素、復(fù)方新諾明敏感，呋喃妥因中介，臨床抗菌治療面臨嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，所以應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該菌的認(rèn)識(shí)和提高監(jiān)控能力顯得十分重要[13]。

肺炎克雷伯菌膜孔蛋白在細(xì)菌耐藥中起重要作用[14]，肺炎克雷伯菌除了主要的膜孔蛋白OmpK35、OmpK36外仍表達(dá)其他膜孔蛋白如OmpK37、OmpKA、PhoE和LamB等。不同的報(bào)道SDS-PAGE檢出膜孔蛋白成份存在差異，García-Sureda等[15]研究中檢測(cè)出OmpK36和LamB膜孔蛋白，同時(shí)認(rèn)為L(zhǎng)amB存在與Omp K36缺失相關(guān)；而意大利學(xué)者采用SDS-PAGE方法檢測(cè)出OmpK35、OmpK36、OmpKA以及變異的OmpK36V[16]。本研究采用SDS-PAGE電泳分析肺炎克雷伯菌膜孔蛋白陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13883及其他對(duì)照株，檢出膜孔蛋白OmpK36和OmpKA，但未檢出膜孔蛋白OmpK35，這與David等[17]的報(bào)道結(jié)果一致，未檢出膜孔蛋白OmpK35。也有報(bào)道認(rèn)為MALDI-TOF MS和SDS-PAGE方法檢測(cè)肺炎克雷伯菌膜孔蛋白時(shí)敏感性不夠?qū)е履た椎鞍譕mpK35易漏檢[18]。而攜帶NDM-1基因的實(shí)驗(yàn)菌膜孔蛋白SDS-PAGE電泳只檢測(cè)到Omp KA，故認(rèn)為實(shí)驗(yàn)菌膜孔蛋白OmpK36缺失，進(jìn)一步對(duì)其膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)存在點(diǎn)突變或片段缺失，認(rèn)為這可能是導(dǎo)致膜孔蛋白OmpK36缺失的主要原因。攜帶NDM-1基因伴膜孔蛋白OmpK36缺失肺炎克雷伯菌株是本地區(qū)首次報(bào)道，表現(xiàn)多重耐藥特點(diǎn)。

MLST基因分子分型提示實(shí)驗(yàn)菌為ST15型；而本院同時(shí)期其他耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌為ST11型，表明該時(shí)期我院耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的主要流行株為ST11，這與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道[19]認(rèn)為ST11是耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的主要基因分子分型，而產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌MLST基因分子分型呈多樣化相一致；提示攜帶NDM-1基因菌株遺傳背景與醫(yī)院流行株差異大，為本院菌株突變而來(lái)的概率低，當(dāng)然也不排除為不同種屬細(xì)菌通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合等方式傳播而獲得NDM-1基因，本文沒(méi)有擴(kuò)大菌種范圍進(jìn)行分析，有待進(jìn)一步深入研究確認(rèn)。

報(bào)道認(rèn)為NDM-1基因是以質(zhì)粒的方式，可在同種或不同種細(xì)菌間傳播[20]。本研究通過(guò)質(zhì)粒接合試驗(yàn)顯示供體菌的NDM-1基因通過(guò)質(zhì)粒傳導(dǎo)給受體菌，受體菌獲得NDM-1基因后從對(duì)碳青霉烯類藥物敏感性發(fā)生改變，表現(xiàn)為對(duì)3種碳青霉烯類藥物美羅培南、亞胺培南、厄他培南耐藥，證明了NDM-1基因以質(zhì)粒方式傳播，也為阻遏攜帶NDM-1基因細(xì)菌之間傳導(dǎo)以免暴發(fā)性流行提供依據(jù)。