非梗阻性無精子癥患者X染色體連鎖的TEX11基因多態性研究

羅招云 李緒杰 林芬 查廣才 楊立業★

在全世界范圍內，男性不育無精子癥的發病率高達15%～20%，并呈現出快速增長的趨勢[1]。男性不育癥已成為一個嚴重的生殖健康問題[2]。大多數非阻塞性無精子癥的遺傳基礎還未知[3]。遺傳因素常被認為是無精子癥中男性不育的主要原因[4]，X染色體連鎖的TEX11基因在睪丸中表達，與精子發生功能有關[5]，TEX11的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與特發性男性不育密切相關[6]。TEX11缺乏導致減數分裂停滯和雄性不育，對無精子癥患者進行TEX11突變篩查是為了查明雄性不育潛在的因素[7]。本研究收集潮州地區35例男性非阻塞性無精子癥患者血液標本，進行TEX11的SNP檢測，探討其與無精子癥發生的關系，對它的發生率及其基因型別進行統計，評估TEX11的SNP與無精子癥之間的相關性及其可能在中國非阻塞性無精子癥患者發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 樣本來源

選取2012年6月至2018年5月來我院泌尿外科和生殖醫學科就診的男性患者為實驗對象，實驗組納入標準參照文獻[8-9]對無精子癥的診斷標準，即射出的精液離心后鏡檢未觀察到精子，且通過3次和3次以上離心鏡檢，同時排除逆行射精和不射精等，即可診斷為無精子癥。離心標準：取出1mL精液，以3000g（4096r/min）離心15min，余下約50μL精漿。以納入標準收集到217例無精子癥患者血液樣本。排除標準為男性無輸精管炎癥、睪丸（附睪）炎癥、精囊炎、輸精管道缺如、輸精管道阻塞、Y染色體微缺失。217例無精子癥患者篩選出35例非梗阻性無精子癥患者為實驗對象，年齡20～43歲，平均年齡（30.11±5.13）歲，平均體重（58.37±2.43）kg。對35例血液標本進行X染色體上TEX11的SNP檢測。

收集2018年2月至5月來本院體檢中心體檢的30例生精正常的男性血液標本作為對照組。年齡26～47歲，平均年齡（32.11±3.57）歲，平均體重（61.37±1.82）kg。經詳詢，30例男性均是在未采取避孕措施下1年內使妻子自然受孕。

1.1.2 儀器與試劑

XP基因擴增儀（型號：TC-XP-D，貨號：BYQ602402Y-273）購自杭州博日科技有限公司；電泳儀：電泳槽（型號：DYCP-38B型，貨號：No.0838B-191-06）和電泳儀電源（型號：DYY-6C型，出廠編號：15。新6C.1210-11），均購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統（Tanon Gellmage System，型號：Tanon-1600，貨號：15T5561-313）購自中國上海天能科技有限公司。外周血全血DNA提取試劑盒（型號：全血DNA溶液型，批號：W201708002）購自深圳亞能生物技術有限公司，DNA maker（型號：M1091/M1092，批號：014）購自廣州東盛生物科技有限公司，2×Tap PCR MasterMix（型號：PC0902，批號：282238AX）購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取

外周血DNA的提取嚴格按照全血DNA提取試劑盒說明書操作，制備好的DNA樣品置于-20℃保存備用。

1.2.2 引物設計和合成

利用Primer premier 3.0引物設計工具，將29個TEX11的基因序列編碼外顯子序列分段設計合成，其中3個基因序列引物自行設計，見表1；另26個基因序列引物參照參考文獻[3]。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增TEX11DNA

在XP基因擴增儀上經過PCR溫度梯度實驗，逐一確定29對引物擴增合適的退火溫度，見表1，PCR擴增的體系參數和反應條件如下：PCR擴增的體系參數：Mix Taq，12.5μL；純凈水，8.5μL；上下游引物各1.0μL；總cDNA，2.0μL；體系總體積25.0μL。PCR反應參數設置：95℃預變性3min；94℃變性30s，退火30s（溫度見表1），72℃延伸50s，循環35次；72℃延伸5～10min。在確定各對引物PCR擴增退火溫度下，對35例非梗阻性無精子癥患者的DNA標本進行外顯子序列分段式擴增。

表1 TEX11基因的3個編碼外顯子DNA引物和PCR擴增退火溫度Table1 The 3coding exon DNA primers of the TEX11 gene and PCR amplification annealing temperature

1.2.4 電泳

用1.5%瓊脂糖凝膠，200V電壓，140mA電流，電泳時間為25min，對PCR擴增產物進行電泳，電泳結束后將凝膠輕置于Tanon 1600凝膠成像系統中，觀察DNA條帶亮度、位置，拍照記錄。

1.2.5 PCR產物測序

將合格的PCR擴增產物送至上海英駿生物技術公司（廣州）進行測序。

1.2.6 基因序列比對

根據測序出來的結果，通過Chromas測序分析軟件人工查看測序圖確認檢測結果是否成功，將測出的正反向基因序列通過pubmed的Nucleotide BLAST數據庫進行比對，以確定非梗阻性無精子癥患者X染色體上的TEX11基因是否發生突變，突變位點排除雜合子突變。

1.3 統計分析

應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，用卡方檢驗對實驗組和對照組的突變率進行統計，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因測序結果分析

在35例實驗組患者標本中檢測到2種錯義突變類型，分別是Exon7：c.389A＞G，突變率37.1%Exon 17：c.1351G＞A，突變率8.6%。2種錯義突變引起的編碼氨基酸變化分別是：c.Lys 130Arg和c.Gl u451Ly s；在對照組中發現Exon7、Exon 17也有相同位點突變，突變率分別為：37.5%、8.3%此外，在實驗組中發現2處同義突變，分別是Exon 27：c.2319 T＞A，突變率為71.4%；Exon 29 c.2541T＞C，突變率為20.0%。在實驗組和對照組中都發現了TEX11的2個外顯子相同位點的突變（Exon 7：c.389 A＞G，Exon 17：c.1351G＞A），見表2和圖1。；。：

表2 非梗阻性無精子癥患者和對照組TEX11基因外顯子編碼基因序列突變[n（%）]Table2 TEX11 genemutation of the exon encoding sequence inmales with non-obstructive azoospermia and the controlgroup[n（%）]

圖1 非梗阻性無精子癥患者TEX11基因的2處錯義突變Figure1 2missensemutations in the TEX11 gene of non-obstructive azoospermia

3 討論

在成人男性中，高達1%的人群患有無精子癥[10]，男性不育患者中有近25%是非梗阻性無精子癥導致的[11]。非梗阻性無精子癥是一種多因素疾病，其分子基礎仍然大部分未知，幾乎一半的男性不育癥與遺傳缺陷有關[3]。目前，國內外對男性非梗阻性無精子癥的TEX11基因突變研究報告極少。關于X染色體上的生精基因研究會逐漸成為國際上的研究熱點，包括TEX11基因在內的基因已被報道為無精子癥的可能關聯因素[12-13]。TEX11基因表達蛋白是一種X染色體編碼的生殖細胞特異性蛋白質，在睪丸中的精原細胞和早期精母細胞中表達量最大[14]。TEX11基因在精子發生早期扮演一個重要角色[15]。TEX11基因是減數分裂的一個明確因素[16]。TEX11基因突變導致減數分裂停滯，是精子形成失敗導致非梗阻性無精子癥的原因，TEX11基因對精子發生障礙有重要意義[3-4]。

目前，由基因異常導致的男性不育主要是：性染色體與生精基因的缺失與突變、常染色體基因的缺失與突變[17]。不少學者研究不育男性X連鎖的TEX11基因突變[3-4]。目前，共發現TEX11基因有46個不同突變[3-4]。TEX11基因突變發生率在德國是2.4%（7/289），在美國無精子癥患者中的發生率是14.5%（35/246）[3-4]，本研究TEX11基因突變發生率是37.1%（13/35）。TEX11基因突變發生率差異可能與種族特點不同有關[7]。在一項試驗中，敲除老鼠TEX11基因上共30個外顯子中的27個，染色體在粗線期不結合使精子發生受損，導致細胞死亡和雄性不育[16]。Yatsenko等[3]通過研究發現6個不同TEX11基因突變，包括外顯子9～11缺失（607del1237bp），3個剪切突變（c.405C＞T，748+1G＞A，1793+1G＞C），2個錯義突變（c.466A＞G，2047G＞A）。Yang等[4]發現40個不同TEX11突變，18個在無精子癥患者中檢測出，包括5個外顯子錯義突變（W117R，V142I，Q172R，T244I，V748A），2個外顯子無義突變（405C＞T，2319T＞C），1個外顯子移碼突變，10個內含子突變；另22個在正常生育男性中發現，其中4個外顯子錯義突變（K115R，M152V，E436K，D832E）。日本研究者[10]對包括TEX11基因在內的25個相關基因進行突變篩選，發現1個TEX11突變（c.A511G，Met171Val）。在中國人群中，僅有1篇文獻報道1對不育兄弟在TEX11基因的29號外顯子上發現2653G＞T[7]。本研究的TEX11基因30個外顯子發現4個SNP，2個外顯子錯義突變（Exon 7：c.389 A＞G；Exon 17：c.1351G＞A）和2種無義突變，與上述研究者發現的基因突變位點均不相同，與歐美基因突變位點不同的原因可能是人種不同；與日本研究者的不同，可能與本實驗樣本例數太少有關。本研究實驗組和對照組中都有相同位點2個錯義突變，推測這2種突變不影響TEX11基因的功能，與Ya n g等[4]研究的結論基本一致。在正常生育男性中發現TEX11基因突變，以及大部分TEX11基因突變準確原因還不明確，可能提示這些突變與無精子生成不相關[4]。這么豐富的TEX11突變增加了診斷導致雄性不育的困難[7]。Zhang等[6]研究闡述了TEX11基因的SNP與無精子癥具有相關性；TEX 11基因突變在男性不育中，特別是與無精子癥有密切相關[7]。

綜上所述，TEX11基因的SNP在非梗阻性無精子癥的臨床意義目前是不明確的，與Mitchell等人[18]的研究結論是一致的，TEX11基因功能目前與男性不育的關系還無定論，本研究結果的結論也是如此。鑒于本研究樣本例數少，生育男性也發現TEX11基因突變，因此在潮州地區人群中TEX11基因與男性不育的關系還有待更進一步深入研究。在檢測TEX11基因突變時，結合睪丸組織學活檢和不育史家系調查，更有助于得出TEX11基因突變與男性不育的相關性[7]。