MALDI-TOFMS在藥物基因組學檢測中的應用及展望

曹書娟 劉彬 朱安娜

藥物基因組學是近年來由藥物遺傳學發展而來的臨床基因檢測新興領域，其研究目的是闡明基因多態性對藥物效應和毒性的影響以及對藥物作用靶點的確定。不同個體的藥物遺傳多態性是藥物基因組學的基礎，表現為藥物代謝酶的多態性、藥物受體的多態性以及藥物靶標的多態性等。在藥物代謝相關途徑中的細胞色素P450（Cytochrome P450proteins，CYP）酶系是最主要的藥物代謝酶，目前已發現的CYP基因至少有53個，其中的CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP1A2、CYP2E的編碼基因具有較為顯著的遺傳多態性意義[1]。在藥物受體基因多態性的研究中最為重要的藥物受體是G蛋白偶聯受體，目前研究較多的是β2-腎上腺素受體[2]，另外5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）載體[3]、維生素D受體（Vitamin D receptor，VDR）[4]和血管緊張素轉換酶等基因多態性[5]對藥物的作用也密切相關。藥物轉運基因及相關疾病通路基因如ApoE基因[6]、編碼P-糖蛋白的基因[7]、VKORC1基因的多態性研究[8]也證實了藥物轉運基因和疾病通路上的靶點基因與藥效之間的密切關系。藥物基因組信息是當前個體化精準醫療的一個重要部分，藥物基因組學的臨床實施可以實現個性化醫學，提高治療的功效，安全性和成本效益。另一方面，通過區分有效適用人群，使得更多的新藥能夠有效通過臨床試驗，為治療提供更多可能。

隨著基因檢測技術的發展，目前已有多種分子檢測平臺可應用于藥物基因組學的研究，包括基于聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術的熒光定量PCR[9]、突變擴增阻滯系統熒光定量PCR[10]、微滴式數字PCR[11]、生物芯片技術[12]、Sanger測序技術[13]和二代測序技術[14]等。這些技術各具特點，也各有局限性。基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOFMS）技術的出現和發展克服了PCR技術多重擴增能力不足的問題，解決了藥物基因組檢測中多個變異位點同時檢測的需求；其不依賴于熒光探針和熒光類試劑的檢測流程，質譜技術的高準確性和高靈敏度保證了檢測的高準確度和重復性；同時其檢測成本相比二代測序技術具備更高的性價比。

越來越多的研究者在MALDI-TOFMS技術平臺上取得了大量的研究成果，MALDI-TOFMS已經成為分子檢測的又一有力工具。本文將系統性的介紹MALDI-TOFMS技術原理和使用該技術開展的藥物基因組相關的研究進展。

1 MALDI-TOFMS技術原理

MALDI-TOFMS出現于20世紀80年代，該技術突破了傳統質譜僅可以進行小分子物質分析的局限，使得核酸、蛋白質等生物大分子也可以應用質譜進行研究[15]，極大推進了基因組學和蛋白質組學的發展，為生物和醫學領域帶來革命性突破。

圖1 MALDI-TOF質譜系統原理圖示（繪制）Figure1 Schematic representation of the MALDI-TOF mass spectrometry system

質譜技術的基本原理是通過將待測樣品離子化，產生一系列不同質荷比的離子，質量分析器能夠測定該樣品中不同種類離子的分子量，按照從小到大的順序依次排列從而得到一張分子量峰圖。質譜儀器可以通過樣品進樣方式、離子源、質量分析器的類型等方面進行分類。其中，MALDI-TOF MS采用的是樣品與基質混合進樣，激光解吸附電離作為離子源以及飛行時間法進行質量分析。

首先，MALDI-TOFMS的電離過程需要基質參與。基質多采用有機酸[16]，因其具有很強的激光能量吸收能力，能夠增強樣品對激光的吸收，同時降低激光對樣品的破壞，對樣品起到保護作用。樣品與基質混合后發生共結晶，經激光照射，基質迅速蒸發，其與樣品之間的分子間作用力快速減弱，樣品分子進而得以釋放。與此同時，基質將吸收到的激光能量傳遞至樣品分子并使其帶上正電荷。該技術靈敏度極高，僅需pmol-fmol級別的微量樣本即可進行檢測[17]。隨后，離子化的樣品分子進入飛行時間質量分析器，通過脈沖電場對離子化的樣品進行加速，不同分子量的離子在真空飛行管內以各自不同的恒定速度向離子檢測器飛行，從而可以區分出樣品中不同分子量的離子（圖1）。在核酸檢測的應用中，分子量的檢測范圍多限制在1000-10000D這個分子量區間內[18]。在現有的成熟應用中，MALDI-TOF能夠檢測的變異類型包括單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）、拷貝數變異（Copy Number Variations，CNVs）、甲基化、插入缺失突變（In/Del）等。

對于藥物基因組學檢測中常見的變異類型：SNP和CNV的檢測，MALDI-TOF主要通過基于多重PCR、單堿基延伸及質譜檢測相結合的技術來實現。例如在SNP檢測中，首先通過PCR的方法將含有待測SNP的目的片段進行擴增，擴增結束后利用蝦堿性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）將體系中的剩余的dNTP去磷酸化不能夠繼續與模板結合。然后在反應體系中繼續加入SNP多態性堿基所對應的單堿基延伸引物（Unlined base Extension Primer，UEP）和雙脫氧核糖核苷（Dideoxynucleotide，ddNTP）等相關成分進行單堿基延伸反應。在這個過程中，UEP可與待測SNP的5′端結合且只延伸一個堿基，根據模板中不同的SNP序列即可得到不同的延伸產物。經離子交換樹脂脫去反應體系中的Na＋、K＋、Mg2+等離子后，即可將反應液進點樣至MALDI-TOF MS專用芯片上進行質譜檢測并得到延伸產物的分子量圖譜（圖2）。

圖2 MALDI-TOFMS檢測實驗流程Figure2 MALDI-TOFMSworkflow

核酸質譜能夠實現在同一個反應孔中對多個不同位點同時進行擴增和延伸，單孔反應最多高達40重。因同一SNP位點上不同基因型（純和型或雜合型）對應的堿基不同，且各個SNP位點上所設計的引物序列不同，即可在結果中以分子量圖譜的形式顯示出同一位點上的不同基因型，并區分出不同位點上的延伸產物峰（圖3）。同樣的原理在檢測基因突變時，在突變位點上檢出的不同堿基即為野生型和突變型。除了基因突變的定性檢測，根據質譜圖譜中檢測峰的峰面積與該分子量核酸片段的含量成正比的關系，還能夠計算出樣本中野生型和突變型在該位點上的比例。目前MALDI-TOFMS能夠檢出最低0.1%的突變比例。

一次質譜可以同時分析多至幾十個位點的基因分型，圖為9個位點同時檢測的結果示例[19]。

圖3 MALDI-TOFMS原始數據Figure3 MALDI-TOFMS rawdata

2 MALDI-TOFMS在藥物基因組相關分子標記檢測中的應用

Liu等研究者為研究相關基因位點對氯吡格雷用藥的影響，在MassARRAY核酸質譜和焦磷酸測序兩種技術平臺上，在458位中國漢族心血管患者群體中，對CYP2C19（*2，*3，*4，*5，*17）和ABCB1C3435T基因上共6個SNP進行了基因分型檢測，并使用Sanger測序作為驗證技術。其中有6份樣本在兩種方法中呈現不同結果。經Sanger測序驗證，MassARRAY平臺的檢測結果與Sanger測序結果完全一致，6個SNP的次等位基因頻率在該患者群體中分別為27.1%（CYP2C19*2），5.9%（CYP2C19*3），0%（CYP2C19*4），0%（CYP2C19*5），1.1%（CYP2C19*17），40.9%（ABCB1）。該項研究的研究者認為MassARRAY核酸質譜技術平臺能夠為氯吡格雷相關藥物基因組檢測提供精準的檢測結果，同時相比于焦磷酸測序MassARRAY能夠實現高性價比、快速出具報告和更高的檢測通量[20]。奧氮平作為二代抗精神疾病藥物，在精神分裂癥的治療中起到非常重要的作用。但不同患者對奧氮平的應答反應個體差異巨大。Zhou等研究者使用MALDI-TOF技術對兩個獨立的實驗組進行12個與奧氮平藥物反應相關的SNP檢測，結果顯示其中有2個SNP在兩個實驗組中均與奧氮平的藥物應答反應顯著相關。并指出這2個SNP在后續臨床開展的奧氮平治療中起到重要參考作用[21]。

CYP2D6基因的CNV也是藥物基因組學研究中常見的一種多態性形式。常見的CNV檢測方法只能對CYP2D6基因的單一區域進行檢測，以確定拷貝數，而人類CYP2D6基因常為與CYP2D7假基因的雜交型基因，因此這些常規方法的單一區域檢測很可能得到不準確的拷貝數或藥物代謝信息。使用MALDI-TOFMS通過對CYP2D6基因中不同區域設計多個檢測位點同時進行檢測，深度覆蓋雜交型CYP2D6基因，能夠獲得更為精準的拷貝數變異信息，通過設計CNV，SNP以及In/del的檢測組合，可以實現對一系列藥物基因組基因位點的同時檢測，提供一套快速，經濟，準確的檢測方案。實驗數據表明MALDI-TOF質譜能夠準確進行CYP2D6基因多態性分型，是一種經濟有效的藥物基因組檢測方案[22]。同時MassARRAY核酸質譜技術也常常作為其他分子檢測技術的驗證標準，Liu等研究者設計了一套基于熒光定量PCR技術的含32個SNP的CYP450家族基因分型和拷貝數變異panel，并使用Mass ARRAY核酸質譜以及數字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）技術對該panel檢測結果進行驗證，結果證明核酸質譜技術具備與ddPCR一致的靈敏度和準確性[23]。美國Assurex公司針對精神類疾病用藥制定了一套基于MassARRAY核酸質譜平臺的檢測方案，和參考方法的平行比較結果具有100%的一致性[24]，基于此Assurex使用該平臺開發的GenesightPGx檢測pane l覆蓋55種常見藥物，檢測量每年超過50萬人次。國內的第三方檢測機構和醫院也逐漸基于此平臺開展高血壓、精神分裂、抑郁癥等疾病用藥基因檢測。

3 展望

現有的可用于藥物基因組學相關研究的技術和平臺，如熒光定量PCR、微滴式數字PCR，生物芯片技術，Sanger測序技術和二代測序技術等，這些技術在實驗操作難度、檢測時間的長短、檢測成本的控制、數據分析難度等方面各有利弊。相比之下，已有大量研究證明MALDI-TOFMS利用多重PCR技術，在同一個反應中同時檢測高達40個變異位點，不但能夠對藥物基因組學中相關SNP進行檢測，還能夠在同一panel中同時檢測CNV和Indel，極大的提高了檢測效率，節約了樣本用量，同時其基于分子量的質譜檢測方式提供了不依賴于熒光信號的檢測準確度，以極高的性價比滿足了藥物基因組分子檢測的需求。美國食品藥品監督管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）已于2018年批準美國Agena Bioscience公司的MassARRAY?MALDI-TOFMS可用于臨床核酸檢測[25]。在中國，達瑞生物的DR MassARRAY飛行時間質譜系統通過了國家藥品監督管理 局（National Medical Products Administration，NMPA）審核，成為國內第一臺獲批IVD核酸質譜檢測系統，批準其SNP方面的應用，如耳聾基因檢測等。

隨著全基因組關聯分析（Genome-wide association analysis，GWAS）生物統計/信息平臺的建立和發展，越來越多的基因多態性信息被發現與藥物在體內的代謝、轉運、和作用靶點密切關聯。自2007年FDA批準了第一種遺傳分子檢測，根據CYP2C9和VKORC1基因多態性預測抗凝藥華法林的敏感性[26-28]，標志著藥物基因組學已經開始由實驗室研究走向實際應用。到目前為止已有140余種藥物經FDA批準，在說明書中附上其藥物基因組信息，用于指示不同基因型的臨床患者在應用該藥物時對療效和毒性的預測作用[28]，其中涵蓋了高血壓、內分泌、哮喘、高血脂、精神類、腫瘤等疾病的藥物治療。在我國，為進一步推進合理用藥、安全用藥，中華人民共和國國家衛生健康委員會于2015年7月頒布了《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術試行指南》（國衛醫醫護便函〔2015〕240號）[29]。在指南中明確指出藥物代謝酶和藥物作用靶點相關的藥物種類及其對應基因，進一步提高了藥物基因組學檢測的重要性并作出規范化的要求。

基于MALDI-TOFMS的核酸檢測平臺具備了獨特的多重PCR技術，穩定且準確的檢測結果，經濟的檢測成本和快速的周轉時間，能夠滿足臨床上越來越多的對中高通量SNP、CNV及Indel變異的定性和定量檢測需求，這些優勢也使得核酸質譜技術在基因檢測領域顯示出強大的競爭力。伴隨全球對藥物基因組研究日益增長的關注度和更多遺傳標記的發現，以及對核酸質譜技術的了解與應用不斷深入，該檢測平臺將成為分子檢測實驗室不可或缺的標準裝備。