鮮姜汁對不同酵母菌抑制作用的研究

楊雷鵬

（山西師范大學(xué)，山西臨汾 041000）

生姜，作為一種常見的香辛料，含有多種生物活性成分，如姜醇、姜酚、姜辣素等，具有抗氧化、抑菌、驅(qū)寒等功效，是藥食兩用作物[1]。醫(yī)學(xué)研究方面，已經(jīng)證明生姜對細(xì)菌有明顯的抑制作用，還兼有軟化血管、降血脂的功效，可用于治療哮喘、腸道潰瘍、心血管疾病等[2-3]。作為天然的抗氧化劑，生姜對于食品工業(yè)和人體健康有重要意義[4]。

目前，國內(nèi)外對于生姜抑菌作用的研究主要集中在細(xì)菌方面，而對于生姜，特別是鮮姜汁對于酵母菌抑菌作用的研究則較少[5-6]。酵母是傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種，主要用于酒類釀造。酵母可利用不同的原料，在不同的發(fā)酵條件下產(chǎn)生各種產(chǎn)物，如脂肪酶、麥角固醇、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸等，在食藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[7-9]。研究鮮姜汁對酵母菌的抑制作用，可為生姜高附加值產(chǎn)品（如生姜酒）的研發(fā)提供理論依據(jù)。國內(nèi)外對于微生物抑菌作用的研究普遍采用的是牛津杯法測量抑菌圈直徑，對微生物的抑菌作用進行觀察[10]。與傳統(tǒng)采用的濾紙片法相比，牛津杯法得到的數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確和客觀[11]，但這種方法在實際操作中會因為各種試驗因素如抑制劑顆粒大小與滲透性等問題的存在而容易出現(xiàn)較大實驗誤差[12]。因此，僅靠單一的實驗方法，確定鮮姜汁對酵母菌抑制作用的強弱存在一定的局限性。本研究以5 種常見酵母菌為材料，利用牛津杯法測定抑菌圈直徑，并與DPPH、ABTS、FRAP 等常用抗氧化活性測定方法聯(lián)用，來綜合考察鮮姜汁對于酵母菌的抑菌作用，為鮮姜汁的進一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無硫生姜：鮮品，購置于臨汾堯都區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

供試菌種：試驗所用5 種酵母菌W.anomalus J7-2、W.anomalus J11-2、W.anomalus J12-7、W.anomalus J15-2、W.anomalus J15-15，均為山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

試驗試劑：無水葡萄糖、麥芽粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DPPH、ABTS、TPTZ、水溶性維生素E（TE），北京伊諾凱科技有限公司；甲醇、冰乙酸、結(jié)晶乙酸鈉、濃鹽酸、過硫酸鉀、氯化鈉、水合氯化鐵，天津科密歐化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA22O4B 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司；HPX-9272 MBE 型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；5804R 型高速冷凍離心機，德國基因有限公司；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司，PH-3C 型pH 計，上海儀電分析儀器有限公司；752N 型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鮮姜汁的制備

將鮮姜洗凈晾干后，放入超凈工作臺中，用研缽研磨成汁，過濾后得到姜汁原液，再按照料液比鮮姜汁:水=1:1、1:2、1:4、1:8、1:16（g:mL）的比例對姜汁原液進行梯度稀釋，得到5 個不同濃度梯度的鮮姜汁。

1.3.2 培養(yǎng)基制備

量取10 °Bx 的麥芽汁1 000 mL，加入15 g 瓊脂，混合均勻后加熱至瓊脂完全溶解，調(diào)節(jié)pH 為6.0，趁熱分裝于250 mL 錐形瓶中，并制備試管斜面，滅菌。

1.3.3 菌種活化

將上述5 種酵母菌分別接入試管斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，取出備用。

1.3.4 菌懸液制備

用接種環(huán)從試管斜面中挑取一定量活化后的酵母菌，放入裝有10 mL 無菌水的試管中，放入恒溫振蕩器中振蕩約10 min，使菌體散開。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 抑菌圈直徑的測定

參考孟君等[13]的試驗方法。取直徑6 mm 的牛津杯，滅菌后備用。用移液槍吸取1 mL 菌懸液于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布器涂布均勻；用無菌鑷子夾取牛津杯緊貼在含酵母菌的培養(yǎng)基上，用移液槍吸取200 μL 鮮姜汁，每個平板上放置4 個同一種濃度梯度鮮姜汁的牛津杯，每個濃度重復(fù)3 次，取平均值作為最終結(jié)果；向牛津杯中移入200 μL 無菌水代替鮮姜汁作為空白對照進行實驗。平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出后測定抑菌圈直徑，比較不同濃度鮮姜汁對于不同種類酵母的抑菌效果。

1.4.2 抗氧化活性的測定

參考范祺、郭京波等[14,15]的試驗方法。在麥芽汁液體培養(yǎng)基中接入1%上述5 種酵母菌菌懸液，并添加200 μL不同料液比的鮮姜汁為底物，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)液全部移入離心管，用5 mL 蒸餾水洗滌三角瓶，洗滌液一同移入離心管，混合均勻后8 000 r/min離心15 min。離心完成后，吸取上清液，用蒸餾水定容到10 mL，分別進行DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、與Fe3+還原能力的測定，以三者相加后得到的總和，作為該酵母菌的總抗氧化活性。以未接種酵母菌的鮮姜汁作為空白對照進行試驗。每次試驗均設(shè)置三個平行，以平行實驗誤差不超過5%為標(biāo)準(zhǔn)，進行結(jié)果與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛津杯抑菌試驗結(jié)果

本試驗通過測定不同平板上5 種酵母菌W.anomalus J7-2、W.anomalus J11-2、W.anomalus J12-7、W.anomalus J15-2、W.anomalus J15-15 抑菌圈直徑（單位：cm），確定不同濃度鮮姜汁對酵母菌的抑制作用，試驗結(jié)果見圖1。

如圖1 所示，隨著生姜料液比的逐漸減小，各個酵母抑菌圈的直徑均開始逐漸變小。從圖中可以看到，鮮姜汁對于不同酵母的抑制作用各不相同：W.anomalus J12-7 所對應(yīng)的抑菌圈直徑較其他4 種酵母而言最小，表明鮮姜汁對該菌種的抑制作用最弱；同理，W.anomalus J15-2 所對應(yīng)的抑菌圈直徑較其他4 種酵母而言最大，表明鮮姜汁對該菌種的抑制作用最強；因此選擇受鮮姜汁抑制程度最小的酵母菌W.anomalus J12-7 進行后續(xù)試驗。此外，就鮮姜汁料液比方面而言，當(dāng)料液比為1:1時，對于各個酵母的抑制作用均相對較強；在料液比為1:1至1:8 之間時，曲線斜率較大，抑菌圈直徑快速縮小；在料液比為1:8 至1:16 之間，曲線斜率較小，表明這一區(qū)間鮮姜汁對于酵母菌抑制作用較小，酵母菌得以持續(xù)生長繁殖，因此，考慮選用生姜料液比為1:8 進行后續(xù)試驗。

2.2 抗氧化能力評價

試驗以200 μL 料液比為1:8 的鮮姜汁為發(fā)酵底物，添加到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，經(jīng)上述5 種酵母菌進行發(fā)酵，測定鮮姜汁在發(fā)酵后的總抗氧化能力（單位：μmol TE/g Ginger juice，以下簡稱μmol/g），結(jié)果見圖2。

如圖2 所示，經(jīng)5 種酵母發(fā)酵后，鮮姜汁的總抗氧化活性（TAC）之間差異顯著，W.anomalus J7-2 為3 345.09±167.26 μmol/g；W.anomalus J11-2 為3 155.65±157.78 μmol/g；W.anomalus J12-7 為3 632.36±181.62 μmol/g；W.anomalus J15-2 為3 223.15±161.16 μmol/g；W.anomalus J15-15為3 023.84±151.19 μmol/g，而對照組總抗氧化活性僅為1 805.96±90.30 μmol/g。其中W.anomalus J12-7 的抗氧化活性最高，發(fā)酵力最強，發(fā)酵液氣味較為柔和，姜辣味顯著降低，并伴有淡淡的葡萄酒香味，表明其對于鮮姜汁轉(zhuǎn)化程度最強。其余4 種酵母菌中，W.anomalus J11-2無明顯特殊氣味產(chǎn)生，姜辣味較為明顯；W.anomalus J15-2 和W.anomalus J15-15 發(fā)酵產(chǎn)物有明顯的啤酒氣味，且姜辣味較濃；W.anomalus J7-2 產(chǎn)生較為濃烈的白酒味，對于生姜汁轉(zhuǎn)化程度不如W.anomalus J12-7。

3 結(jié)論

本文通過研究鮮姜汁對5 種常見酵母菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)W.anomalus J12-7 無論是牛津杯抑菌試驗，還是抗氧化能力評價，相對其他酵母菌而言，除具備較強耐受性能外，也展現(xiàn)出較高的抗氧化活性，這表明W.anomalus J12-7 在發(fā)酵過程中對于鮮姜汁中部分物質(zhì)進行了分解與轉(zhuǎn)化，并生成具有更高生物活性的物質(zhì)，具體的轉(zhuǎn)化物質(zhì)與相對應(yīng)的轉(zhuǎn)化機理仍有待于進一步的試驗研究。