SIRT1選擇性激動劑改善肺氣腫大鼠肺損傷及其相關機制的研究

顧超

在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者中，長期氣流受限的主要原因是肺泡結構的破壞，進而導致氣腔的擴大以及肺彈性組織降解［1］。引起肺氣腫及COPD最主要的危險因素是吸煙［2］。在哺乳動物中，肺泡上皮細胞是由I型肺泡上皮細胞（type I alveolar epithelial cells，AECI）和Ⅱ型肺泡上皮細胞（type II alveolar epithelial cells，AECII）組成。其中，AECII是AECI的祖細胞，并且在分泌肺泡表面活性物質、維持肺泡內液體平衡等方面發揮重要的作用［3］。Sirtuins是Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶，能夠對多種非組蛋白去乙酰化，在基因轉錄、能量代謝和細胞衰老中起到重要作用［4］。前期已有研究表明，SIRT1水平的下降會促進COPD患者的內皮祖細胞衰老和功能異常［5］。本研究通過SIRT1選擇性激動劑SRT2104治療肺氣腫大鼠，并檢測其對大鼠肺損傷的修復作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 （1）實驗動物：清潔級的雄性SD大鼠45只，體重170～200g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，并飼養在浙江中醫藥大學動物實驗中心，飼養溫度為21℃～25℃，相對濕度為40%～60%，12h明暗交替。（2）主要試劑：兔抗大鼠SPA和SPC抗體、羊抗兔IgG二抗（購自美國Santa Cruz公司），TRIzol（購自美國Invitrogen公司），雄獅牌香煙（購自浙江中煙工業有限公司）。SIRT1去乙酰化酶檢測試劑盒（購自美國Enzo Life Sciences公司）；細胞衰老相關β-半乳糖苷酶染色試劑盒（購自江蘇碧云天公司）；SRT2104（購自美國MedChem Express公司）。

1.2 方法 （1）肺氣腫大鼠模型的建立和SRT2104治療：將45只清潔級的雄性SD大鼠完全隨機平均分為3組，每組各15只，A組（正常對照組）、B組（肺氣腫組）、C組（肺氣腫+SRT2104治療組）；根據本課題組的前期方法［6］建立肺氣腫大鼠的實驗模型。C組大鼠于建模第12周后開始按100mg/（kg·d）劑量灌胃SRT2104，共4周；其中，B組大鼠每天給予相同體積的生理鹽水灌胃。（2）肺功能檢測：采用小動物肺功能儀測定各組大鼠的肺功能，大鼠麻醉消毒并切開頸部皮膚，將氣管倒“T型”切開，用食道插管經口插入大鼠食道中部，并連接壓力傳感器記錄食道壓（胸腔負壓）、“Y型”套管氣管插管，采集信號，通過MPA肺功能分析計算氣道阻力（airway resistance，AR）、肺動態順應性（pulmonary dynamic compliance，Cdyn）及呼氣峰值流速（（peak expiratory flow，PEF）并取平均值。（3）大鼠肺組織病理學分析：大鼠肺功能測定后采用10%水合氯醛行腹腔麻醉處死。取肺組織，固定脫水后石蠟包埋并切片后，行蘇木素-伊紅（HE）染色，根據本課題組前期方法［6］，采用肺組織病理半定量分析其肺泡平均內襯間隔（mlI）和平均肺泡面積（MAA）。（4）Realtime PCR測定SPA和SPC mRNA表達：收集各組大鼠肺組織，按試劑盒的說明書合成cDNA，按照前期方法［6］行Real-time PCR，并以GAPDH作為內參；以2-ΔΔCt分析目的基因的相對表達。其中，引物序列如下：SPA正義鏈5'-TCGGTGTCCCAGGATTTAG-3'，反 義 鏈 5'-CAGGGTGGCTGCTGTTAGT-3'；SPC正 義 鏈5'-CAGACACCATCGCTACCTT-3'， 反 義鏈 5'-TAGCCAAAGCCTCAAGACT-3'；GAPDH 正義鏈5'-GTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，反義鏈5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。（5）Western blot測定SPA及SPC蛋白水平：按照本課題組前期方法［6］進行。（6）衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性測定：采用染色法測定大鼠肺組織的SA-β-gal活性，按照試劑盒說明書操作。（7）SIRT1去乙酰化酶活性檢測：以比色法測定大鼠肺組織SIRT1去乙酰化酶活性，嚴格按試劑盒說明操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件包。計量資料以（±s）表示，統計分析采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn及PEF比較 見表1。

表1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn及PEF比較［n=15，（±s）］

表1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn及PEF比較［n=15，（±s）］

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別 AR［cm/（ml·s）］ Cdyn（ml/cm） PEF（ml/s）A組 0.120±0.033 0.316±0.022 14.212±1.697 B組 0.341±0.028 * 0.179±0.017 * 6.882±1.452 *C組 0.254±0.022 *# 0.208±0.031 *# 10.420±3.663 *#F值 45.042 53.332 7.346 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 肺組織病理學改變 各組大鼠的肺組織采用常規HE染色，B組及C組大鼠的肺組織出現肺氣腫病理特征：部分肺泡出現囊狀擴張，部分肺泡腔不規則，并且相同視野內的肺泡數目顯著減少，部分肺泡間隔出現斷裂，進而肺泡融合；但是，SRT2104治療后肺組織肺氣腫改變程度顯著減輕，見圖1。肺組織病理的半定量分析證實，B組大鼠肺組織mlI及MAA顯著高于A組（P＜0.05），而SRT2104治療后（C組）大鼠肺組織mlI及MAA顯著低于B組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠肺組織的mlI及MAA變化（n=15，±s）

表2 各組大鼠肺組織的mlI及MAA變化（n=15，±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別 mlI（μm） MAA（μm2）A組 64.34±12.33 4938.39±501.92 B組 121.65±12.22* 12488.89±1146.42*C組 80.98 ±11.30 *# 7983.88±358.12 *#F值 28.782 97.367 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖1 各組大鼠肺組織病理學改變（HE染色，×200）

2.3 SPA和SPC mRNA表達水平 采用Real-time PCR檢測大鼠肺組織的SPA和SPC mRNA表達水平，結果表明，與A組比較，B組大鼠肺組織中SPA及SPC mRNA的表達明顯降低（P＜0.05）；而SRT2104治療后（C組）大鼠肺組織SPA及SPC mRNA的表達顯著高于B組（P＜0.05），見圖2。

2.4 SPA及SPC蛋白表達 Western blot測定大鼠肺組織的SPA和SPC蛋白的表達水平，結果表明，SPA及SPC蛋白在B組大鼠肺組織中表達明顯低于A組（P＜0.05）；但是SRT2104治療后（C組），SPA及SPC蛋白表達顯著高于B組（P＜0.05），見圖3；其結果與SPA及SPC mRNA在大鼠肺組織中表達一致。

2.5 SA-β-gal活性變化 采用染色法測定大鼠肺組織的SA-β-gal活性，大鼠肺組織中被染色成藍色的細胞即為SA-β-gal陽性的細胞，即為衰老細胞，其大多數位于肺泡角部。結果顯示，與A組比較，B組大鼠肺組織中的SA-β-gal陽性細胞顯著增多，但是SRT2104治療后（C組），大鼠肺組織SA-β-gal陽性的細胞顯著減少，見圖4。

圖2 各組大鼠肺組織的SPA和SPC m R N A水平。注：與A組比較，★P＜0．05；與B組比較，# P＜0．05

圖3 各組大鼠肺組織SPA及SPC蛋白表達。注：與A組比較，★P＜0．05；與B組比較，#P＜0．05

圖4 各組大鼠肺組織的SA-β-gal活性變化（× 400）。

2.6 SIRT1去乙酰化酶的活性改變 比色法檢測大鼠肺組織SIRT1去乙酰化酶活性，結果表明，與A組比較，B組大鼠肺組織SIRT1去乙酰化酶活性顯著降低（P＜0.05），而SRT2104治療后（C組），大鼠肺組織中的SIRT1去乙酰化酶活性明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

到2020年，預計COPD將會是全球死亡原因的第三位因素，給社會和家庭帶來巨大的負擔［2］。COPD的發病機制復雜，其病變可以累及肺實質和肺血管等，并且進行性發展［1］。本研究中，通過被動吸煙及大鼠氣道內脂多糖吸入建立肺氣腫模型，肺組織出現明顯的肺氣腫病理表現，包括肺泡出現囊狀擴張，部分肺泡間隔出現斷裂，進而肺泡融合。并且肺功能檢測也表明肺氣腫大鼠氣道阻力顯著增加，而肺動態順應性及呼氣峰值流速明顯降低，符合肺氣腫的變化。

作為AECI的祖細胞，AECII在分泌肺泡表明活性物質、維持肺泡內穩態及氣體交換和提高肺組織修復能力方面具有重要的作用，并且SPA及SPC是由AECII特異性地分泌。與上述研究相同的是，在本研究中，肺氣腫大鼠肺組織中的SPA及SPC mRNA及蛋白表達水平明顯降低，表明其肺組織中AECII存在受損。但是，SRT2104治療后，大鼠肺功能中的氣道阻力、肺動態順應性及呼氣峰值流速得到改善，并且肺組織肺氣腫表現好轉。但是，通過SRT2104治療來改善肺氣腫大鼠肺功能的相關機制需要進一步闡明。作為SIRT1的選擇性激動劑，SRT2104具有重要的病理生理學功能；如減輕心肌纖維化、改善動脈內皮細胞功能障礙、緩解骨質疏松。相關研究證實，細胞衰老在COPD患者中會加速，并且促進COPD進展［7］。肺氣腫患者肺泡細胞衰老的水平與其氣流受限的程度呈正相關。因此，作者假設肺氣腫大鼠的肺泡上皮細胞異常表達可能與其過早衰老相關。SIRT1是長壽基因，具有顯著的逆轉衰老的能力，并且具有較高的安全性和抗炎活性［8］。SA-β-gal是細胞衰老重要生物標記物。

本研究中，C組肺氣腫大鼠經SRT2104治療后，肺組織中的SPA及SPC mRNA及蛋白表達水平顯著升高，考慮其相關機制可能是SRT2104通過改善或者修復Ⅱ型肺泡上皮細胞的數量或者功能來改善肺氣腫大鼠的肺損傷。作者進一步采用染色法和比色法來測定大鼠肺組織中SA-β-gal活性變化及SIRT1去乙酰化酶的活性改變，發現C組肺氣腫大鼠肺組織中SA-β-gal陽性細胞顯著減少，并且SIRT1去乙酰化酶活性明顯升高，結果表明SRT2104治療后大鼠肺組織中衰老的肺泡細胞明顯減少。綜上所述，SIRT1選擇性激動劑SRT2104可能通過抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞衰老或者促進肺泡上皮細胞的進一步修復來改善肺氣腫大鼠的肺損傷。但是，SRT2014上述功能的信號調控機制仍需進一步研究。