Galectin-3及midkine 含量評價甲狀腺癌小鼠模型的實驗價值研究

吳元肇 陳立

甲狀腺癌是臨床上常見的內分泌惡性腫瘤，發病率占全系統惡性腫瘤的約1%左右，根據其組織改變，可分為乳頭狀癌、髓樣癌、濾泡性癌及未分化癌，以乳頭狀癌為臨床常見類型，其預后較好，密集的乳頭狀結構、毛玻璃樣核、核內假包涵體及核異型重疊是其鏡下特征性表現，最佳的治療方法是手術治療；濾泡狀癌及未分化癌的惡性程度較高，若治療不及時，則預后不佳［1-2］。已有文獻報道，甲狀腺乳頭狀癌中的galectin-3陽性表達率高達90%以上，腫瘤的生長發育及惡化轉移與midkine表達有緊密的聯系，故本研究通過建立小鼠異種移植瘤模型，檢測甲狀腺癌組織中的galectin-3及midkine，目的是探討在甲狀腺癌組織中galectin-3及midkine 的表達特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究選取的是健康雌性潔凈級小鼠20只，重量18～24g，由本院實驗室動物房提供［動物合格證號：SCXK（X）2010-0003］。在實驗開始前，對小鼠進行為期7d的適應性喂養，且無不良反應的小鼠納入實驗。將復制成功的甲狀腺癌小鼠模型及甲狀腺腫小鼠模型應用于本次實驗研究中，手術前8h禁食水。

1.2 實驗環境 本次實驗飼養小鼠階段及模型復制階段全程于本院教學動物實驗室進行，該實驗室環境良好，通風佳，自然采光。小鼠培育期間，室內溫度控制在21℃～25℃，濕度控制在40%～60%，12h為1個明暗周期。

1.3 腫瘤細胞株來源 甲狀腺乳頭狀癌K1細胞株標本取自臨床，保種于本院實驗室，儲存于液氮中。

1.4 實驗試劑 高糖無酚紅DMEM培養基（上海潤成生物科技有限公司），胎牛血清（FBS）（武漢普諾賽生命科技有限公司），胰蛋白酶（上海如吉生物科技發展有限公司），Ⅱ型膠原酶（北京智杰方遠科技有限公司），4-甲基偶氮四唑藍（MTT）（美國Sigma），二甲亞砜（DMSO ）（天津市鼎盛鑫化工有限公司），β-雌二醇（上海笛柏生物科技有限公司），人促甲狀腺激素（TSH）（廣州兆康生物科技有限公司），注射用青霉素（華北制藥，執行標準：《中國獸藥典》），注射用硫酸鏈霉素（南岸區渝鑫獸藥經營部，執行標準：《中國獸藥典》），RIPA蛋白裂解液（上海朝瑞生物科技有限公司），半乳糖凝集素-3（Galectin-3）（上海晶抗生物工程有限公司，規格：48T/96T），人中期因子（MK）（廣州邊金生物科技有限公司，規格：48T/96T），RPMI 1640培養基（液體）（北京中西遠大科技有限公司，規格：BS32-R7131），磷酸鹽緩沖液（PSB）（南京便診公司，規格：BZW12084）。

1.5 實驗方法 （1）細胞培養：甲狀腺乳頭狀癌K1細胞在含有青霉素、硫酸鏈霉素及10%FBS的RPMI 1640液體培養基中常規培養。1～2d換液1次，3～4d傳代。（2）小鼠移植瘤模型的建立：將20只裸鼠隨機分為2組，即空白對照組（Z組）及實驗組（M組），每組各10只。分別選用2種細胞中生長狀態良好者重懸于無血清的液體培養基中，將最終的濃度設置為5×107。將配制好的2種細胞懸液分別注射至2組裸鼠的右側腋窩皮下組織，注射量為0.2ml/只。在全部注射之后，連續30d不間斷地觀察并記錄，于第31天將20只小鼠全部斷頸處死，并切取腫瘤組織以備后續實驗繼續進行。（3）結果判定：血清galectin-3及midkine 陽性表達的判斷依據為：由于陽性的染色信號呈棕黃色顆粒，位于細胞質和（或）細胞核，細胞染色的強度顯著性高于其底色。根據著色程度和范圍，“-”為陽性細胞數＜10%，“++”為陽性細胞數＞50%，“+”為陽性細胞數介于10%～50%。（4）組織切片的制備：將組織塊切成約0.5cm厚度，固定于包埋盒內，用流水沖洗24h，然后將組織用酒精逐步脫水。將移植瘤標本取出，并放入二甲苯中浸泡變為透明，將制備成的石蠟塊在4℃冰箱中保存以備用。標本切片，厚度約為4μm，放置于恒溫60℃環境中烘烤6～12h。（5）免疫組織化學染色檢測galectin-3及midkine蛋白質：以PSB代替一抗作陰性對照，使用二甲苯將組織切片進行脫蠟，酒精泡，然后用PSB沖洗切片。分別在對應相應組別加入galectin-3及midkine稀釋后的抗體（稀釋度比例為1∶200），在4℃濕盒中過夜，再用PSB洗滌，滴加Ⅱ抗，再用PSB洗滌。滴加DAB顯色劑，蘇木精伊紅復染2min。常規鹽酸酒精脫水，脫水、透明、封片、鏡檢。（6）Western Blot檢測腫瘤組織galectin-3及midkine蛋白表達情況：組織總蛋白提取：取出凍存的腫瘤組織100mg，置于10ml的離心管中；加入RIPA裂解液，以4℃，1000rpm，離心后取上清液。根據Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定，應用酶標儀確定所測蛋白樣本在A595nm的OD值，空白對照組是濃度為零孔的BSA的OD值，確定標準曲線，計算所有樣品中的蛋白濃度。Western Blot實驗步驟：首先配制分離膠，迅速混勻，然后配制濃縮膠，將蛋白樣品及Marker依次加入到濃縮膠凹槽，80V恒壓電泳進行10min預電泳，將電壓調整到120V恒壓，當嗅酚藍到達底部時，立即停止電泳；取出活化的PVDF膜，洗膜后置于封閉液中，并在溫度為4℃環境下過夜；稀釋一抗，比例為1∶500，在溫度為37℃恒溫箱中孵2h；TBST洗膜10min，共3次，稀釋二抗，比例為1∶5000，加入稀釋后的二抗溶液3ml，在溫度為37℃恒溫箱中孵1h；二抗結合以后，TBST洗膜l0min，共計3次，按1：1的比例混合適量ECL。滴加顯色液，凝膠成像系統顯色并記錄實驗結果。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料服從正態分布者以（±s）表示，組間采用獨立樣本t檢驗。偏態數據則進行適當轉化。各組數據平均數之間的差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠甲狀腺組織中galectin-3及midkine 蛋白的含量比較情況 見表1。

表1 兩組小鼠甲狀腺組織中galectin-3及midkine蛋白的含量比較［ng/ml，（±s）］

表1 兩組小鼠甲狀腺組織中galectin-3及midkine蛋白的含量比較［ng/ml，（±s）］

組別 例數 galectin-3 midkine Z組 10 13.27±0.76 7.35±0.98 M組 10 30.82±4.63 43.71±7.21 t值 12.284 19.349 P值 0.026 0.009

2.2 免疫組織化學檢測結果 見表2。

表2 兩組小鼠甲狀腺組織中galectin-3及midkine蛋白的表達總陽性率比較［n（%）］

3 討論

甲狀腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，且發病率已呈逐年上升的趨勢，甲狀腺癌的發病與遺傳因素、電離輻射、雌激素水平、碘攝入量及居住環境等因素密切相關。對于甲狀腺癌的術前診斷，以彩色多普勒超聲結合細針穿刺細胞學病理為主，結合BRAF基因檢測，有較高的確診率。

胡海霞等［3］綜述了galectin-3的研究現狀，關于 galectin-3的結構特征，Barondes等［4］研究學者于1994年正式提出將之前稱之為S-lac凝集素統一命名為Galectin，需要符合在糖識別域有相似的顯著序列（可采用X線衍射晶體分析法證實與其相關的氨基酸殘基）和對β-半乳糖具有親和力兩條標準，目前已經發現的galectin有15種。許文瓊等［5］學者認為Galectin-3的過度表達使腫瘤細胞與基底膜之間的粘附增強，Galectin-3參與機體炎癥反應，主要通過誘導肥大細胞活化，嗜堿性細胞釋放介質而發揮作用，Galectin-3抗細胞凋亡，這可能與bcl-2和蛋白序列同源性有關系，Galectin-3調節細胞周期，可能與其參與了細胞的生長和凋亡有關，Galectin-3調節細胞粘附，Galectin-3具有橋梁的作用，可使相鄰細胞交聯，此外Galectin-3還具有對前 mRNA 的剪接活性。杜馥曼等［6］研究提示Galectin-3是臨床上鑒別診斷甲狀腺良性、惡性疾病的分子標記物，在甲狀腺乳頭狀癌、濾泡狀腺癌等上皮來源組織中為高表達，如果在細針穿刺抽取細胞標本的基礎上，將免疫組化方法與之相聯合應用，將顯著提高臨床術前甲狀腺癌的確診率，增強特異性、敏感性，降低假陽性率。

Midkine又名中期因子，是視黃酸誘導的小鼠胚胎腫瘤細胞系胞cDNA 文庫的新表達產物，Midkine在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態，如乳腺癌、肺癌、消化系統惡性腫瘤、膀胱癌等［7-8］。張曙光等［9］認為midkine是一段富含半肽氨酸的堿性多肽，成人的midkine在血管內皮細胞、小腸黏膜組織及部分臟器的粘液上皮細胞中呈高表達，在甲狀腺組織中呈中表達，在肺臟、脾臟、胃、結腸及腎臟中呈低表達，在肝臟中沒有表達。midkine可促進腫瘤的發生發展、轉移惡化、不良預后及耐藥性。杜麗娟等［10］認為midkine受體包括跨膜蛋白和跨膜蛋白多糖，是一個分子復合體，目前已確定的受體包括受體型蛋白酪氨酸磷酸酶、變性淋巴瘤激酶、低密度脂蛋白受體相關蛋白整合蛋白以及NGC等，但迄今為止仍無明確的有關midkine的完整信號通路的報道；midkine在腫瘤發生中的作用，可用于腫瘤的基因治療，midkine啟動子在腫瘤中有較高的活性，但在正常組織中的活性較低，故此可以推斷midkine啟動子具有腫瘤特異性。楊鵬飛等［11］研究表明甲狀腺惡性結節患者血清中midkine濃度水平顯著性升高，對臨床診斷甲狀腺惡性結節有較高的應用價值。寶榮等［12］研究結果顯示，甲狀腺良性結節組織、甲狀腺惡性結節組織中的midkine表達率分別為87%和6.7%、平均表達評分分別為1.98和0.07，甲狀腺乳頭狀癌Ⅲ、Ⅳ兩期惡性程度較高，多伴有甲狀腺腺外侵襲、淋巴結轉移，其midkine呈強陽性表達，甲狀腺乳頭狀癌組織中的BRAF基因突變率為63%，而在癌旁正常甲狀腺組織中未檢測到有midkine表達及BRAF基因突變，這表明在甲狀腺乳頭狀癌組織中midkine表達增高，且表達量與甲狀腺乳頭狀癌的惡化程度及是否發生BRAF基因突變有關。王麗等［13］研究表明midkine mRNA在甲狀腺癌組織中呈高表達狀態，且與疾病的惡化程度呈正相關關系。衛文俊等［14］研究提示在分化型甲狀腺癌組織中midkine呈高表達狀態，與腫瘤新生微血管形成有關，在腫瘤的生長發育及轉移中均具有重要作用。

綜上所述，本實驗研究通過建立小鼠異種移植瘤模型，觀察galectin-3及midkine 蛋白含量對診斷及鑒別診斷甲狀腺癌的臨床價值。結果顯示，galectin-3及midkine 蛋白在甲狀腺癌小鼠體內呈高表達狀態。galectin-3及midkine可作為臨床鑒別診斷甲狀腺癌的輔助診斷指標。