飛行時間質譜技術在沙門氏菌快速鑒定及同源性分析中的應用

王蔚 高雯潔 侯柏龍

沙門菌是引起人類胃腸炎或食物中毒最常見的病 原菌之一，主要通過污染食物和水源引起傳播，引發公共危害［1］。沙門菌屬菌型繁多，根據抗原結構不同可有2500多個血清型，不同血清型感染后產生的癥狀不同，治療方法也不同［2］，所以對其不同型別的快速鑒定及分型至關重要。生化反應鑒定、血清學凝集分型、耐藥譜分型和分子診斷技術等是目前常用的沙門菌鑒定分型方法［3］。生化反應和血清學分型為傳統檢測方法，結果可靠但操作繁瑣，周期長；耐藥譜分型臨床應用性強，操作簡便，菌種間可比性差；PFGE分型可區分不同菌株間的細微差別，為分子流行病學分型金標準，但是操作技術要求較高，試驗耗材昂貴，較難在常規實驗室開展。基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術是近幾年才發展起來的一種用于微生物鑒定和分型的新型方法，相對于傳統的生化及血清型分型，其操作簡便、快速，并具有高通量、低成本等優點，越來越多地用于微生物的檢測，同時有研究表明質譜技術通過比較蛋白指紋圖譜，亦可進行同源性分析［4］。本實驗比較了MALDITOF MS和常用方法在沙門氏菌鑒定及同源性分析的結果，探尋更方便、準確、快捷的沙門氏菌鑒定分型方法，進一步優化臨床微生物標本檢測流程。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集本院2017年5月至2018年6月門診及住院患者的腸道標本共1940份，分離培養沙門氏菌。質控菌株：大腸埃希菌ATCC8739由法國梅里埃公司惠贈，分子質量參考菌株：沙門氏菌國際標準菌株H9812，由浙江省疾病預防控制中心提供。

1.2 試劑與儀器 乙腈；α-氰基-4-羥基肉桂酸基質液CHCA；血平板（法國梅里埃）；木糖賴氨酸去氧膽酸鈉瓊脂平板（XLD）、改良磺綠增菌液（SBG）（上海科瑪嘉微生物技術有限公司）；沙門屬60種診斷血清（寧波天潤生物藥業有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒；內切酶XbaI（美國Promega）、蛋白酶K（德國MERCK）；PFGE專用瓊脂糖SeaKem Gold Agarose（美國Lonza）。CHEF Mapper脈沖場凝膠電泳儀和GEL Doc EQ凝膠成像分析系統（美國DADE BEHRING ）；BacT/ALERT 3D 血培養儀、VITEK MALDI-TOF MS及VITEK2 Compact全自動微生物鑒定儀均購自法國梅里埃公司；力康Heal Force生物安全柜 HF safe 1500TE B2Ⅱ（中國力康）；低溫冰箱（Haier，中國海爾）。

1.3 菌株生化鑒定及血清分型 將收集的可疑菌株分別調0.5麥氏濁度，采用VITEK-2 COMPACT 儀器配套GN16卡進行生化鑒定，并用沙門菌屬診斷血清進行確認分型。

1.4 MALDI-TOF MS菌種鑒定 采用MALDI-TOF MS SARAMIS系統對上述菌株進行鑒定：（1）在生物安全柜內取經18～24h培養菌落少量均勻涂于靶板，每個菌株涂1孔，完全干燥后加CHCA基質液1μl，待基質液干燥后移出生物安全柜；（2）質譜檢測：采用正線性模式，激光頻率60Hz，加速電壓20kV，離子源加速電壓167kV，170ns離子延時引出，質譜區間設定的質核比（M/Z）為2000～20000Da，質控品為大腸埃希菌ATCC8739，采用VITEK MALDI-TOF MS IVD3.0版本進行結果比對。檢測結果以成功鑒定為沙門氏菌屬即可滿足要求。

1.5 耐藥譜分群 根據美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）推薦，對38株鼠傷寒菌株進行K-B法藥敏試驗，檢測氨芐西林（AMP）、頭孢他定（CAZ）、頭孢曲松（CRO）、環丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、復方新諾明（SXT）耐藥性。根據耐藥譜結果分為4群，分別為1群全部敏感，2群單耐AMP，3群同時耐AMP和SXT，4群為耐多藥沙門菌，即同時耐AMP、SXT和三代頭孢菌素（CAZ/CRO）或喹諾酮類（CIP/LEV），又可根據具體耐藥情況將4群分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個亞群。

1.6 PFGE分型 按沙門氏菌脈沖場凝膠電泳標準操作規程進行：（1）細菌的包埋；（2）細菌的裂解；（3）清洗膠塊；（4）膠塊內DNA的酶切；（5）加樣和電泳；（6）圖像的獲取；（7）數據的分析。用Xba 1內切酶37℃酶切4h后上機電泳，最小分子量30K，最大分子量700K，初始轉換時間2.16s，終末轉換時間63.8s，電壓梯度6V/cm，夾角：120°，線性，起始電流：140mA。成像后用BioNumerics 6.6軟件分析。

1.7 MALDI-TOF MS 分型及圖譜比較 在SARAMIS數據庫界面，導入需進行同源性分析的38株鼠傷寒沙門菌質譜圖，進行同源性分析，并形成同源性圖譜。

2 結果

2.1 菌株鑒定與血清分型 1940份腸道標本培養分離沙門氏菌127株，陽性率為6.55%（127/1940）。所有菌株經血清凝集試驗確定分型，分別是B群60株，占總檢出沙門菌的47.24%（60/127），其中鼠傷寒沙門菌55株，占總檢出沙門菌43.31%（55/127）。見表1。

表1 127株沙門氏菌各血清型檢出比例表

2.2 MALDI-TOF MS鑒定結果 見表2。

表2 127株沙門菌質譜儀鑒定結果

2.3 耐藥譜分群 根據耐藥性檢測結果將38株鼠傷寒沙門菌分為4個群，其中3群最多，占42.11%；1群最少，占10.53%。見表3。

表3 38株鼠傷寒沙門菌耐藥譜分群表

2.4 MALDI-TOF MS及PFGE同源性分析結果 38株鼠沙門氏菌用Xba 1內切酶酶切，經脈沖場凝膠電泳后得到清晰的DNA指紋圖，通過BioNumerics 6.6軟件聚類分析，各菌株間相似度介于65.3%～100.0%之間，相似度為100.0%的PFGE型有6個。在SARAMIS數據庫界面，對38株鼠沙門氏菌進行同源性分析，發現有36株菌相似度介于80.0%～90.0%之間，無相似度為100.0%的菌株。

3 討論

沙門氏菌常引起人類傷寒、副傷寒和急性腸胃炎，其中鼠傷寒沙門氏菌主要引起人類食物中毒［5］。在我國，有數據顯示70%～80%的細菌性食物中毒由沙門氏菌引起［6］。因此，快速準確地鑒定沙門氏菌并明確其分型對臨床診療和感染預防均有重要的意義。

本次實驗共檢測到127株沙門氏菌，其中鼠傷寒沙門菌55株（43.31%），說明本地區流行株以B群鼠傷寒沙門菌為主，與其他地區的研究結果相似［7］；C群沙門菌檢出菌種較多，均較分散。一般認為MALDI-TOF MS鑒定可信度達＞80%，結果較為準確［8］。本資料中，在菌屬水平上MALDI-TOF MS對沙門氏菌的鑒定符合率達98.42%，結果可靠。但利用儀器自帶的數據庫尚不能將菌株準確分型，這是由于血清學方法是根據細菌的抗原差異來區分類型，而MALDI-TOF MS是通過檢測細菌蛋白質組成的分布進行鑒定的新方法，細菌的遺傳狀態、所處環境及抗生素使用所導致耐藥譜的不同均會影響菌株的蛋白表達，進而影響分型的確定［9］。有研究顯示，將臨床菌株質譜數據補充至質譜儀鑒定數據庫，可以增加MALDI-TOF MS對沙門菌的分型鑒定能力［10］。

對沙門氏菌耐藥譜分群可幫助臨床選擇合適有效的抗生素，是實用的分群方法。本資料顯示，AMP的耐藥率達89.47%，提示AMP不能作為治療沙門菌感染的首選藥。細菌不同的耐藥譜即意味著不同的蛋白表達，因此可以利用MALDI-TOF MS尋找特異性差異峰構建鑒定模型，從而達到對沙門氏菌耐藥譜分群的目的，當然需要進一步補充數據庫。

細菌同源性分析有助于疾病預防部門系統地開展溯源分析及分子流行病學研究，而PFGE是實現這一目標的可靠方法，但其實驗繁瑣，難以常規開展。有研究顯示，MALDI-TOF MS可對肺炎克雷伯菌進行同源性分析，結果可靠［11］。但本資料結果顯示，MALDI-TOF MS對38株鼠傷寒沙門氏菌同源性分析結果與PFGE差異較大，說明尚不能依賴MALDI-TOF MS對傷寒沙門氏菌進行同源性分析。

綜上所述，MALDI-TOF MS技術可用于沙門氏菌的快速鑒定，血清分型則需借助血清凝集試驗，同源性分析與PFGE具有較大差異。進一步完善MALDITOF MS比對數據庫，探索MALDI-TOF MS在沙門氏菌同源性分析時的影響因素將是今后的研究方向。