雷公藤甲素通過調控Toll-樣受體（TLR）/核因子κB（NF-κB）信號通路對糖尿病腎病模型小鼠足細胞的作用研究

任凌燕 朱 鳴 朱華艷 丁 敏 費丹峰 霍麗霞 王霄一

糖尿病能夠誘發足細胞損傷，使足細胞形態和細胞連接間隙發生改變，最終導致蛋白尿和糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）形成[1]。因此，DN 在一定意義上被認為是一種“足細胞疾病”。雷公藤甲素能夠減輕DN 足細胞損傷，改善腎小球濾過膜通透性，降低尿蛋白，改善血漿白蛋白水平，起到保護患者腎功能的作用[2]。Toll-樣受體4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）作為炎癥反應脅迫的重要調節劑，其表達水平的升級或過度激活可能是導致糖尿病腎臟損傷的重要機制之一[3]。本實驗應用9 周齡db/db 小鼠為研究對象，以TLR/NF-κB 信號通路和足細胞損傷為重要切入點，觀察雷公藤甲素治療DN 的療效，探索其防治DN 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 9 周齡健康雄性BKS-db/db 小鼠18 只，體質量（38.25±1.42）g，9 周齡BKS-db/m 對照小鼠6 只，體質量（20.10±1.50）g，均購于南京大學模式動物研究所，實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2015-0001，動物倫理批件號：IACUC-20190729-09，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心，溫度24～28℃，濕度75%左右，適應SPF 環境1 周，自由攝食基礎飼料。

1.2 藥物與試劑 雷公藤甲素（批號ST8290）購自北京索萊寶科技有限公司，高效液相色譜測試表明，藥物純度在99%以上，用少量二甲基亞砜將藥物完全溶解，然后用生理鹽水配制相應濃度（5μg/mL）。替米沙坦（批號ST9190）購自北京索萊寶科技有限公司，用生理鹽水配制相應濃度（0.5mg/mL）。小鼠尿微量白蛋白酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（批號E038）、血清白蛋白（批號A028-1）、血糖（批號BC1875）、血清肌酐（批號BC1875）、血清總膽固醇（批號A111-1）、血清三酰甘油（批號F001）均購自南京建成生物科技有限公司。Nephrin 抗體（批號ab216341）、Podocin 抗體（批號ab50339）、TLR4 抗體（批 號ab13556）和NF-κB（p65）抗 體（批 號ab246347）均購自英國Abcam 公司。通用免疫組化染色試劑盒（批號ZLI908）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。總蛋白提取試劑盒（批號WB-0072）、BCA蛋白定量試劑盒（批號BCA02）、內參GAPDH（批號GA-003R）、蛋白Marker（批號PM-0011）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批號WB-0131）均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 9 周齡BKS-db/m 小鼠6 只為正常對照組，18 只9 周齡BKS-db/db 小鼠按照隨機數字表法分為DN 對照組、替米沙坦組及雷公藤甲素組，各6 只。各組小鼠自由進食、進水，保持墊料干燥，12h明暗交替照明。

2.2 給 藥 替米沙坦組予替米沙坦懸液（5mg/kg）灌胃，1 天1 次；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液（50μg/kg）灌胃，1 天1 次；正常對照組和DN 對照組給予等量0.9%生理鹽水灌胃，1 天1 次，持續給藥8 周。

2.3 24h 尿蛋白定量檢測 給藥后第8 周，使用小鼠代謝籠收集各組小鼠24h 尿液并記錄尿量，低速低溫離心機（SIGMA，德國）中2500r/min×3min 離心，離心半徑13.5cm，去除沉渣。按試劑盒檢測說明采用ELISA 法進行尿白蛋白測定。

2.4 血生化指標檢測及腎組織取材 給藥后第8周，小鼠處理前稱重，心臟取血，分離血漿，-20℃保存，使用HITACHI7080 全自動生化分析儀進行血清白蛋白、血糖、肌酐、總膽固醇、三酰甘油測定。剝離雙側腎臟，用濾紙吸干雙腎表面血液后稱重，計算腎臟指數[腎臟指數=左腎質量（g）/體質量（g）×100%]。右腎1/2 保存于福爾馬林溶液中用于石蠟包埋，剩余右腎1/2 與左腎液氮冷凍后保存于-80℃冰箱用于蛋白印跡法（Western blot）檢測。

2.5 免疫組化法（IHC）檢測小鼠腎臟WT1 蛋白表達并計數足細胞數量 取各組小鼠左側腎臟石蠟切片標本脫蠟、脫水，抗原暴露，先后滴加一抗（WT1 1:200），二抗（1:5000），DAB 顯色后脫水、透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察各組小鼠腎臟WT1 表達并取圖。采用disector/fractionator 方法計數各組小鼠的足細胞數量[4]。

2.6 Western blot 檢測小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4 及NF-κB 表達 稱取各組小鼠左腎臟組織50mg 于4mL 離心管中，加入細胞裂解液、蛋白酶抑制劑等使之充分混合后，冰浴20min，低溫離心5min，收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白轉至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉并行一抗Nephrin（稀釋度1:500）、Podocin（稀釋度1:2000）、TLR4（稀釋度1:500）、NF-κB（稀釋度1:1000）、GAPDH（稀釋度1:10000）進行孵育，在4℃過夜，用Tris 緩沖鹽溶液洗滌膜，加入第二抗體（稀釋度1:2000）孵育并洗滌膜。用高靈敏度化學發光試劑（ECL）研制該膜，并用凝膠成像分析系統對該帶進行分析。以GAPDH 為內參照，獲得目標蛋白的相對表達。

2.7 腎臟組織病理學改變 將取好的各組小鼠右腎1/2 組織用體積分數10%的甲醛溶液固定腎組織，常規石蠟包埋，2μm 厚切片，行過碘酸雪夫反應染色（PAS），觀察腎臟組織病理學變化情況。

2.8 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件，計量資料均進行正態分布和方差齊性檢驗，計量資料以均數±標準差（）表示，方差齊性時多組間比較采用單因素方差分析；方差不齊性時采用Brown-Forsythe 分析。非正態分布的計量資料采用Kruskal-Wallis H 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠一般情況比較 與正常對照組比較，DN 對照組、替米沙坦組及雷公藤甲素組小鼠逐漸出現精神萎靡、毛色不順滑、多飲、多食、多尿以及消瘦等癥狀，且DN 對照組小鼠癥狀更典型。

3.2 各組小鼠24h 尿蛋白定量、體質量及腎臟指數變化 實驗第8 周，DN 對照組小鼠24h 尿蛋白定量較正常對照組明顯增加（P＜0.01），替米沙坦組和雷公藤甲素組較DN 對照組24h 尿蛋白定量明顯下降（P 均＜0.01），替米沙坦組與雷公藤甲素組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。肉眼可見DN 對照組、替米沙坦組、雷公藤甲素組小鼠腎臟體積明顯增大，質地柔軟，腎臟周圍有大量脂肪包繞，剖面皮質腫脹且蒼白，髓質呈現暗紅色。DN 對照組小鼠體質量、腎臟指數較正常對照組小鼠明顯增加（P 均＜0.01），替米沙坦組、雷公藤甲素組較DN 對照組腎臟指數明顯下降（P 均＜0.01），見表1。

表1 各組小鼠24h 尿蛋白定量、體質量及腎臟指數比較（）

表1 各組小鼠24h 尿蛋白定量、體質量及腎臟指數比較（）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎病；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01

3.3 各組小鼠血生化指標比較 實驗第8 周，與正常對照組比較，DN 對照組小鼠血糖、血清肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平明顯升高（P 均＜0.01），血清白蛋白明顯下降（P＜0.01）。與DN 對照組比較，雷公藤甲素組血清肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平明顯下降（P 均＜0.01），血清白蛋白水平明顯升高（P＜0.01），但雷公藤甲素組與替米沙坦組療效基本相當（P 均＞0.05）。雷公藤甲素組、替米沙坦組小鼠血糖水平與DN 對照組小鼠比較，差異無統計學意義（P 均＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠血生化指標比較（）

表2 各組小鼠血生化指標比較（）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎病；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01

3.4 各組小鼠腎臟病理改變 DN 對照組小鼠腎小球體積明顯增大，細胞數量增加，系膜基質擴張，毛細血管壁增厚以及足細胞增生和肥大。替米沙坦組和雷公藤甲素組，腎小球體積較DN 對照組小鼠明顯縮小（見插頁圖1）。DN 對照組小鼠足細胞計數較正常對照組小鼠明顯下降（P＜0.01），替米沙坦組和雷公藤甲素組足細胞數量較DN 對照組明顯上升（P＜0.01），雷公藤甲素組優于替米沙坦組（P＜0.05），見表3。

圖1 各組小鼠腎臟病理改變（PAS×400，IHC×400）

表3 各組小鼠足細胞計數比較（個/腎小球，）

表3 各組小鼠足細胞計數比較（個/腎小球，）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎病；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01；與替米沙坦組比較，cP＜0.05

3.5 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NFκB 蛋白表達比較 實驗第8 周，DN 對照組小鼠足細胞相關分子Nephrin、Podocin 蛋白表達量較正常對照組明顯下降（P 均＜0.01），替米沙坦組與雷公藤甲素組較DN 對照組明顯上升（P 均＜0.01），且雷公藤甲素組優于替米沙坦組（P 均＜0.05）。DN 對照組小鼠TLR4、NF-κB 蛋白表達量較正常對照組明顯上升（P 均＜0.01），替米沙坦組與雷公藤甲素組較DN 對照組明顯下降（P 均＜0.01），替米沙坦與雷公藤甲素療效無差別（P 均＞0.05），見表4、圖1。

表4 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB蛋白表達量比較（）

表4 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB蛋白表達量比較（）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎病；Nephrin 為腎病蛋白；Podocin為足突蛋白；TLR4 為Toll-樣受體4；NF-κB 為核因子κB；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01；與替米沙坦組比較，cP＜0.05

圖1 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB 的Western blot 結果

4 討論

DN 是終末期腎臟疾病最常見的微血管并發癥，15%～25%I 型糖尿病患者和30%～40%II 型糖尿病患者均會受到影響[5]。研究證實，炎癥和免疫因素是DN的重要發病機制之一[6]。足細胞損傷在DN 發病機制中扮演重要角色，DN 早期就伴隨有足細胞結構與功能的變化以及數量的減少[7-8]。

雷公藤甲素的抗炎與免疫抑制作用早已得到證實[9]。雷公藤甲素能夠上調足細胞重要分子Nephrin、Podocin 的表達及調整其分布，減輕足細胞損傷，降低蛋白尿[10]。本實驗結果顯示，雷公藤甲素可以顯著降低DN 模型小鼠蛋白尿，其效果與替米沙坦片基本相同（P＞0.05）。既往研究表明，高脂血癥對腎臟系膜細胞、足細胞有毒害作用[11]。本實驗發現雷公藤甲素能夠升高DN 模型小鼠血白蛋白，降低其肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平（P 均＜0.01），說明雷公藤甲素能夠改善脂質代謝紊亂，保護腎功能。DN 模型小鼠足細胞重要分子Nephrin、Podocin 蛋白水平以及足細胞數量明顯下降（P 均＜0.01），雷公藤甲素能夠明顯提高Nephrin、Podocin 蛋白水平以及降低足細胞數量（P 均＜0.01）。以上結果進一步證明，雷公藤甲素可能通過保護腎臟足細胞使蛋白尿、脂質代謝紊亂減輕，進而保護腎功能。

炎癥介質在DN 發生、發展中起到重要的作用，表現為促炎癥介質和趨化因子的增加[6]。現有研究提示，炎性因子介導的信號通路的激活有可能會造成細胞的損傷，TLR-NF-κB（Toll-like receptors and Nuclear factor-kappaB）信號通路就是其中的一條通路[12]。不同的Toll 樣受體（TLRs）在與相應的配體結合后，活化核轉錄因子NF-κB，進而導致促炎性細胞因子和趨化因子增加，最終引起炎癥反應[13-14]。據報道，在所有TLRs 中，TLR4 與急性腎損傷，慢性腎臟病和DN 的發生關系最密切[15-16]。NF-κB 的激活促進了DN 炎癥反應及腎臟纖維化[3]。已經證明，TLR4/NFκB 通路的促炎癥作用與糖尿病相關并發癥的發展有關[17]。但是足細胞損傷和耗竭的機制以及足細胞是否促進DN 腎小球炎癥反應尚未明確。實驗證實，暴露于高糖的足細胞和腎小管上皮細胞會促進TLR4的激活，從而導致NF-κB 活化以及隨之而來的炎癥和纖維化反應[18]。同時，NF-κB 的活化也能夠明顯促進高糖誘導的足細胞進一步損傷以及TLR4 的表達增加[19]。以上證據表明TLR4/NF-κB 通路參與DN 足細胞損傷過程。本研究顯示，DN 模型小鼠足細胞重要分子Nephrin、Podocin 蛋白水平明顯下降（P 均<0.01），TLR4、NF-κB 蛋白表達量明顯上升（P 均<0.01），經雷公藤甲素治療后，Nephrin、Podocin 蛋白表達量明顯上升（P 均<0.01），TLR4、NF-κB 蛋白表達量明顯下降（P 均<0.01）。腎臟病理也證實了雷公藤甲素能夠明顯改善DN 腎臟病變情況。本研究無法確定TLR4、NF-κB 在導致DN 足細胞損傷中占有主導地位，但提示TLR4、NF-κB 在足細胞損傷中占有重要作用。

綜上所述，雷公藤甲素可能通過抑制TLR4/NFκB 通路減輕炎癥反應和足細胞損傷從而改善DN。