碘乙酸致大鼠膝骨關節炎疼痛模型的實驗研究

周 康 葉妙勇 馬 軻 單樂天

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種復雜的多病因退變性關節疾病[1-3]。其典型特征是關節軟骨退變，軟骨降解、關節局部炎癥、軟骨下骨硬化、韌帶和關節腔退變等一系列退行性病變，最終引起關節疼痛、僵硬、失用等行為功能障礙[4-6]。目前臨床尚無滿意的治療方法，而疾病晚期外科手術是唯一的治療手段。因此，早期進行OA 防治尤其重要。但獲取足量適合研究的早期OA 人類骨標本較為困難。因此，動物模型在研究早期OA 病程變化中起到重要作用。關節疼痛、僵硬是OA 的主要癥狀，通過建立關節疼痛動物模型是研究OA 病理機制、治療及預防的必要手段，而現有的OA 動物模型并不能反映關節疼痛的變化，通過動物關節腔注射碘乙酸溶液是目前最適合研究疼痛OA 模型最合適的方法[7]。但是目前尚無統一的碘乙酸模型的劑量標準[8-10]。本實驗通過大鼠膝關節腔內注射不同濃度碘乙酸溶液，探究碘乙酸致大鼠OA 的濃度及時間規律。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級雄性SD 大鼠72 只，體質量為（200±10）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，并由浙江中醫藥大學實驗動物中心[SYXK（浙）2018-0012]飼養。飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及自由飲水，控制溫度（23±2）℃和濕度60%，12h 循環燈光。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，所有操作均符合實驗動物倫理學要求（倫理審批號：IACUC-20190909-26）。

1.2 試 劑 生理鹽水（杭州潤澤科學器材有限公司，規格：2.5mL）、碘乙酸（上海聯碩生物科技有限公司，規格：25g，批號64-69-7）；4%多聚甲醛（杭州諾森德生物技術有限公司，規格：500mL，批號BL539A）、EDTA 脫鈣液（杭州禾惠化工有限公司，規格：500mL，批號R20403-500mL）、水合氯醛（上海化學試劑采購供應五聯化工廠，規格：250g，批號302-17-0）。

1.3 儀 器 微量注射器：（Hamilton，US，型號：Model 710 N SYR）、電子機械痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司，型號：YLS－3E），足底熱輻射測痛儀（UGO BASILE，Italy，型號：37370）、大鼠抓力儀（北京冀諾泰科技發展有限公司，型號：ZS000012）、熒光倒置顯微鏡（ZEISS，Germany，型號：AXiovert200）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及造模 72 只SD 大鼠適應性飼養1周后按照隨機數字表法分為對照組及碘乙酸低、中、高濃度組，各18 只。將實驗動物用10%的水合氯醛溶液以0.3mL/100g 的劑量腹腔注射實施麻醉后，膝關節脫毛、消毒。一手使膝關節屈曲90°，另一手觸摸找出股骨髁、髕骨及髕韌帶。微量注射器針頭緊靠髕韌帶兩側髕骨下方對準股骨髁方向進針，當感到明顯的落空感時即已進入關節腔內。對照組雙側膝關節各注射50μL 生理鹽水，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側膝關節分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL[11-12]。操作完成待大鼠蘇醒后放回籠內飼養。

2.2 一般形態觀察及取材 造模后第1、7、14、21、28、35 天后觀察大鼠一般情況，測量熱痛值、機械痛值。每次測量后碘乙酸低、中、高濃度組各隨機處死3只大鼠，處死后截斷雙側脛骨、股骨中部，取一側膝關節進行常規組織石蠟切片、SO 染色，顯微鏡下觀察軟骨組織學特征，另一側膝關節取股骨，去除關節周圍軟組織，充分顯露關節面并觀察比較關節面組織形態學表現變化。

2.3 機械痛值測量 模型建立后1、7、14、21、28、35天測量機械痛值。將大鼠足背置于電子機械痛儀的扁型壓頭下，開始施壓，當動物因疼痛出現嘶鳴或掙扎時停止施壓，此時顯示屏上顯示的克數即為該大鼠的機械痛閾值。每測完1 次機械痛后讓大鼠鎮靜5min，測3 次取平均值。

2.4 熱痛值測量 模型建立后1、7、14、21、28、35 天機械痛測定后5h 測定熱痛值。將大鼠置于足底熱輻射測痛儀玻璃板上的透明有機玻璃箱內，待大鼠安靜后（即停止梳理毛發和探索性活動，約15min），將測試儀上的“十”字形標記置于大鼠后足底中央并避開足墊，測試計時，待大鼠抬足，計時自動停止，記錄時間。把光熱開始照射大鼠足底到抽腳反應的潛伏期定為傷害性感受閾。取前后（間隔5min）3 次測量的平均值作為測量值。為防止大鼠熱輻射燙傷，將大鼠熱痛閾值測定時間上限值設定為20s，溫度上限值設定為35℃[13]。

2.5 大體及病理觀察 每次測量后每組隨機處死3只大鼠，處死后截斷一側脛骨、股骨中部，取膝關節置于4%甲醛溶液中固定48h，EDTA 脫鈣4 周，酒精逐級脫水，浸蠟包埋后在切片機上沿膝關節矢狀面將脛骨外側平臺軟骨下松質骨和股骨外側髁軟骨下松質骨均沿下肢縱軸方向作切片，厚度5μm，常規SO 染色、封片，置光鏡下對其組織結構進行詳細的觀察并參照Mankin 關節軟骨病理評分標準進行積分統計[14]。Mankin 評分標準[15]：正常0 分，表面不規則1 分，血管翳2 分，血管翳和表面不規則3 分，到過渡帶的裂隙4 分，到放射帶的裂隙5 分，到鈣化帶的裂隙6 分；細胞評分：正常0 分，彌漫性細胞過多1分，局部細胞增多2 分，細胞過少分；基質染色：正常0 分，輕度減少1 分，中度減少2 分，重度減少3 分，未著色4 分；潮線完整性：完整0 分，被血管破壞1分；總分14 分。另一側去除關節周圍軟組織，充分顯示股骨關節面，觀察比較關節面的光澤及完整度。

2.6 統計學方法 應用DPS 9.5 軟件進行數據統計分析，四組大鼠機械痛值及熱刺激痛值測量結果以均數±標準差（）表示，組間整體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較 所有大鼠于造模結束麻醉蘇醒后均能自由活動下肢，而在造模后第2 天，碘乙酸高濃度組大鼠出現膝關節僵直腫脹，無法自由活動（見插頁圖1）。碘乙酸低、中、高濃度組大鼠造模后7 天內少動，精神較正常組稍差。造模后碘乙酸低、中、高濃度組大鼠體質量與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

3.2 各組大鼠機械痛閾值比較 對照組大鼠機械痛值較為穩定，僅有小幅度波動，沒有疼痛反應。造模后，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠機械痛閾值即開始下降，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；而且碘乙酸中濃度組大鼠機械痛閾值低于低濃度組，高濃度組大鼠機械痛閾值低于低、中濃度組（P＜0.05 或P＜0.01）；且在造模第21 天，碘乙酸中、低濃度組機械痛閾值均低于同組其他時間點（P＜0.05）；碘乙酸高濃度組在造模14 天，機械痛閾值均低于該組其他時間點（P＜0.05）。見表2。

3.3 各組大鼠熱刺激痛閾值比較 造模后，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠熱刺激痛閾值均低于對照組（P＜0.01）；第7、21、28 天，碘乙酸中濃度組大鼠熱刺激痛閾值均低于低濃度組（P＜0.05）；第14、28、35天，碘乙酸高濃度組大鼠熱刺激痛閾值低于中濃度組（P＜0.05）；第7、14、21、28 天，碘乙酸高濃度組大鼠熱刺激痛閾值低于低濃度組（P＜0.05）。碘乙酸低濃度組28 天和35 天熱刺激痛閾值低于21 天，中濃度組第21 天及28 天熱刺激痛閾值低于第14 天及35 天，高濃度組第28 天熱刺激痛閾值低于第21 天及35 天（P＜0.05）。見表3。

3.4 各組大鼠病理切片比較 對照組大鼠膝關節軟骨切片表面光滑平整，軟骨細胞分布均勻，排列整齊，偶有軟骨細胞肥大，各層次清晰，無明顯細胞簇集現象，潮線完整，潮線下骨小梁無斷裂減少。與對照組相比，碘乙酸各濃度組大鼠膝關節軟骨面均有不同程度缺損，低濃度組表層軟骨細胞局部缺失、各層軟骨細胞排列尚可，移行層出現少量軟骨細胞簇，軟骨下骨小梁尚完整。碘乙酸中、高濃度組局部染色不均勻。碘乙酸中濃度組軟骨細胞明顯減少、排列紊亂，軟骨底層可見大量肥大的軟骨細胞；關節軟骨破壞至軟骨下骨，軟骨下骨硬化，骨小梁面積明顯減小，骨髓腔細胞增生、排列紊亂，骨小梁中的骨細胞明顯減少。碘乙酸高濃度組軟骨層破壞嚴重，軟骨表面多處缺損，凹凸不平，軟骨細胞數目減少，細胞簇集現象明顯，移行層可見較多肥大的軟骨細胞，關節破壞區表層覆蓋大量的纖維素，潮線模糊斷裂，骨小梁中僅存少量軟骨細胞，見插頁圖2。

表1 各組大鼠體質量變化（g，）

注：對照組雙側膝關節各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側膝關節分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；n 為各組大鼠數

表2 各組大鼠機械痛閾值比較（g，）

注：對照組雙側膝關節各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側膝關節分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；n 為各組測量的鼠足數量；與對照組同期比較，aP＜0.01；與碘乙酸低濃度組同期比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與碘乙酸中濃度組同期比較，cP＜0.05；與同組其他時間點比較，dP＜0.05

表3 各組大鼠熱刺激痛閾值比較（s，）

表3 各組大鼠熱刺激痛閾值比較（s，）

注：對照組雙側膝關節各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側膝關節分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；n 為各組測量的鼠足數量；與對照組同期比較，aP＜0.01；與低濃度組同期比較，bP＜0.05；與中濃度組同期比較，cP＜0.05；與碘乙酸低濃度組第21 天比較，dP＜0.05；與碘乙酸中濃度組第14 及35 天比較，eP＜0.05；與碘乙酸高濃度組第21 及35 天比較，fP＜0.05

圖1 高濃度組大鼠一般情況

圖2 各組大鼠膝關節軟骨組織切片（SO 染色×50）

3.5 各組大鼠Mankin 評分比較 與對照組比較，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠膝關節軟骨組織Mankin評分顯著增高（P＜0.01）；且碘乙酸高濃度組大鼠膝關節軟骨組織Mankin 評分高于低、中濃度組，中濃度組高于低濃度組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠膝關節軟骨組織切片Mankin 評分比較（分，）

表4 各組大鼠膝關節軟骨組織切片Mankin 評分比較（分，）

注：對照組雙側膝關節各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側膝關節分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；與對照組比較，aP＜0.01；與碘乙酸低濃度組比較，bP＜0.05；與碘乙酸中濃度組比較，cP＜0.05

4 討論

通過膝關節注射碘乙酸建立大鼠OA 模型是一種簡單、快捷、成模率高、病理表現與人骨性關節炎相似的方法，而且能夠造成大鼠關節疼痛，便于對模型的評估，同時也能夠模擬OA 臨床的關節疼痛表現，為臨床研究提供有利條件[16]。然而現在對于通過大鼠膝關節注射碘乙酸建立OA 模型尚無統一劑量標準[8-10]。

實驗結果表明，通過大鼠膝關節注射碘乙酸溶液后能夠建立典型的OA 模型，引起明顯的疼痛，且具有劑量和時間效應，隨著注射碘乙酸濃度的增加，大鼠膝關節的損傷更為嚴重，表現為機械痛、熱痛閾值的下降，軟骨損傷更加嚴重，在造模后21～28 天損傷最為嚴重。這是由于碘乙酸有破壞關節軟骨和周圍滑膜韌帶的作用，將其注入關節腔內，能改變關節腔原有的穩態，還可引起關節內炎癥反應，從而改變軟骨和軟骨下骨的新陳代謝，破壞關節內環境的穩定，使軟骨細胞凋亡、軟骨磨損。同時造成關節內其他結構的損傷，關節周圍組織增生形成骨贅，最終發展為OA，而在造模后35 天，從機械痛閾值與熱痛閾值上反映，大鼠的疼痛有所改善，這可能與膝關節軟骨細胞的自我修復有關，但其具體機制仍有待進一步探究[17-18]。