成纖維細胞生長因子受體2 過表達具有促進細胞增殖的作用

王澤鑫，張佳欣，閆方泰，張寧，王紹清

齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江齊齊哈爾 161000

成纖維細胞生長因子受體 （fibroblast growth factor receptor，FGFR）在多種細胞中廣泛表達，結合成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）參與調節細胞增殖，分化和生長等重要的生理過程。 在腫瘤的發生發展過程中，多種癌細胞中FGFR 信號通路發生異常改變，包括基因的突變，擴增，基因重排或異位和基因融合等[1]。

肝內膽管細胞癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是來源于肝內膽管上皮的惡性腫瘤，其發病率有增加的趨勢。 吉西他濱加順鉑是目前晚期ICC 治療的標準非治愈性化療方案， 目前缺乏有效的二線化療方案?，F階段通過高通量分子生物學方法已經鑒定出ICC中一些有效的基因治療靶點，如臨床上FGFR 基因異常表達的ICC 患者可能受益于FGFR 靶向治療[2]。 這些研究結果提示FGFR 信號通路在ICC 的發生發展中發揮重要的作用。 該研采用FuGENE HD 介導的FGFR2 質粒瞬時轉染Hucct1 和HEK293T 細胞，觀察其在細胞水平對細胞增殖能力的影響， 為進一步研究FGFR2 信號通路在ICC 靶向治療中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 培養基（ThermoFisher-11885，美國），胎牛血清（Gibco-16140071,美國），pcDNA3.1-TOPO-FGFR2（GenBank：FGFR2IIIb M97193.1） 質粒由該課題組構建并保存。鼠單克隆Bek 單克隆抗體（SC-6930，美國）、鼠抗 Actin（sc-8432,美國）、羊抗鼠 IgG 二抗（Invitrogen-35513，美國）、FuGENE HD Transfection Reagent（羅氏E2311， 美國），OptiMEM 低血清培養基 （Invitrogen-31985070，美國），特超敏ECL 化學發光試劑盒（碧云天P0018AS，中國），CCK8 細胞增殖檢測試劑盒（碧云天-C0037,中國）。 其它化學試劑均為國產分析純及進口分裝。 主要儀器包括 CO2 細胞培養箱 （Thermo -8000，美國）、 YJ1452 型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠，中國），紫外可見分光光度計（UV1902PC，中國）等。

1.2 質粒瞬時轉染

質粒轉染參照說書進行，簡述如下。 細胞轉染前1 d 以 4×105/mL 的密度接種于 6 孔板中，加入 2 mL 不含抗生素、含血清培養基，待Hucct1 和HEK293T 細胞融合達到85%融合時進行質粒轉染。FuGENE 轉染試劑與OptiMEM 培養基混合孵育5 min 后再加入適量質粒（FuGENE HD：質粒=3：1）混合孵育 15 min。 每 6 孔板加入適量混合液。 細胞繼續培養48 h 后收集細胞進行后續實驗。

1.3 Western Blot 檢測蛋白表達

質粒轉染48 h 后， 提取細胞總蛋白并定量。 進行12% SDS-PAGE 電泳，然后將蛋白轉移至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉2 h。 轉印后PVDF 膜依次與一抗 （1：1 000）,二抗（1：5 000）進行免疫印跡反應后進行 ECL 發光,蛋白條帶表達通過Image J 軟件進行分析。實驗重復3 次。

1.4 CCK8 檢測細胞增殖

CCK8 檢測細胞增殖按說明書進行，分別在轉染后12 h，24 h 和 48 h 檢測 450 nm 波長的 OD 值。 細胞以1×104個/100 mL 加入 96 孔板中，每孔加入 10 μLCCK8溶液，加入細胞培養液和CCK8 溶液的無細胞孔為空白對照組。 細胞放入在培養箱中繼續培養1 h 后，使用酶標儀在450 nm 進行檢測OD 值。每個樣本設5 個副孔。實驗重復3 次。

1.5 統計方法

應用SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（）表示，進行t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染 pcDNA3.1-TOPO-FGFR2 質粒細胞內FGFR2 蛋白表達增加

質粒轉染后48 h 后，Western Blot 檢測結果顯示：與未做處理的Hucct1 細胞相比， 轉染組Hucct1 細胞FGFR2 蛋白的表達量明顯增加,差異有統計學意義（P＜0.01）。 與未做處理 HEK293T 細胞相比， 轉染組HEK293T 細胞內FGFR2 蛋白的表達量也明顯增加,差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 各組細胞FGFR2 蛋白表達水平(±s)

表1 各組細胞FGFR2 蛋白表達水平(±s)

注：1 vs 2, P=0.006； 3 vs 4, P=0.001

組數 細胞類型 FGFR2 蛋白表達1 2 3 4 Hucct1 對照組Hucct1 轉染組HEK 293T 對照組HEK 293T 轉染組0.214±0.039 0.411±0.009 0.195±0.026 0.447±0.032

2.2 FGFR2 過表達促進細胞增殖能力

在轉染 FGFR2 質粒后 12 h，24 h，48 h 后檢測各組細胞增殖能力。 結果顯示，在轉染后48 h，HEK293T 對照組 450 nm OD 值為（0.413±0.008）, 轉染后 HEK293T OD 值為 （0.676±0.033）（t=7.699，P＜0.000）； 對照組Hucct1 OD 值 （0.527± 0.015）, 轉染后 Hucct1 細胞 OD值（0.769±0.035）（t=6.205，P＜0.000）。結果提示，在細胞內過表達FGFR2 基因具有促進非腫瘤細胞及腫瘤細胞增殖的能力。

3 討論

FGFR 是一種跨膜酪氨酸激酶受體，在不同的細胞中參與細胞分化、生長、遷移、傷口愈合和血管生成等生物學過程。 該家族包括FGFR1,FGFR2,FGFR3HE FGFR4 四種。 已有研究證實FGFR 受體家族胞外區2個或3 個免疫球蛋白（Ig）樣結構域可與多種FGF 配體結合并相互作用， 逐級催化酪氨酸激酶催化結構域和具有多個酪氨酸磷酸化的羧基末端結構域位點， 激活多條下游信號通路而發揮作用[3]。 在人類，由于FGFR2 基因 mRNA 選擇性剪切，FGFR2 基因有 FGFR2IIIb 和FGFR2IIIc 兩種亞型，FGFR2IIIb 主要表達于上皮細胞，FGFR2IIIc 主要表達于間質細胞中。 通過基因測序鑒定出 ICC 中 FGFR2 基因亞型為 FGFR2IIIb 型[4]，該次研究選擇以人FGFR2IIIb mRNA 目標基因構建的pcD NA3.1-TOPO-FGFR2 表達質粒為研究對象，在細胞水平上研究FGFR2 基因對膽管癌細胞生物學功能的影響。

在許多研究報道中，FGFR2 家族是原癌家族成員之一，具有促進腫瘤生長的作用，如乳腺癌中FGFR2 陽性率為68.67%(57/83）， 高于正常對照組; 而且FGFR2的高表達與腫瘤的進展和臨床分期密切相關（P＜0.05）；Guy 報道，2%胃癌組織中存在FGFR2 基因擴增， 并且FGFR2 基因的擴增與患者不良預密切相關， 以上結果提示FGFR2 基因的擴增是腫瘤的發生發展過程中的關鍵節點[5-6]。 最近研究中報道FGFR2 基因的異常表達，如基因突變（p.N549H, p.N549K, p.V564F, p.E565A and p.K659M)、基因擴增、融合（如 FGFR2-ACSL5 融合）與肝內膽管細胞癌的發生發展關系密切， 可能是一個新的基因治療靶點[4,7-10]。Ding 等[4]在動物實驗研究中發現，FGFR2 基因融合具有促進裸鼠膽管癌病人來源異種移植腫瘤的生長[68 d 腫瘤體積(1 210±127.9)mm3]，應用小分子酪氨酸激酶Dovitinib 抑制劑后， 腫瘤體積較對照組明顯縮小[68 d 腫瘤體積(269.7±24.98）]，并且治療組腫瘤組織內FGFR2 蛋白及其下游AKT 蛋白的表達較對照組表達下降（P＜0.01）,說明 FGFR2 信號通路與ICC 的發生發展有關[4]。

Rizvi S 等[7]研究發現 YAP 基因通過激活 FGFR2 基因促進Hucct-1 細胞的增殖，Md Wahiduzzaman[11]等研究通過基因敲除人間皮瘤細胞系 NCI-H2052 細胞FGFR2 基因的表達抑制了該細胞的增殖能力， 以上研究結果顯示FGFR 具有促進腫瘤細胞增殖的能力。該研究得出相似的結果， 在膽管癌細胞中過表達FGFR2 具有促進細胞增殖的作用。 在人膽管癌Hucct1 細胞和HEK293T 細胞中過表達FGFR2IIIb 基因后， 觀察其對細胞生物學行為的影響。 瞬時轉染FGFR2 基因后，FGFR2 蛋白在 Hucct1 細胞 [（0.411±0.009）vs （0.214±0.039）] 和 HEK293T 細胞 [（0.447±0.032）vs （0.195±0.026）]中表達明顯增加，說明pcDNA3.1-TOPO-FGFR2在細胞內轉染成功。在細胞內過表達FGFR2 基因后，通過CCK8 檢測細胞增殖能力的變化， 研究結果顯示HEK293T 和 Hucct1 在轉染后 48 h 細胞增殖能力[（0.676±0.033），（0.769±0.035）]較未做處理的對照組相比[（0.413±0.008）,（0.527±0.015）]，在 450 nm OD 值明顯增加， 說明FGFR2 基因表達具有促進膽管癌細胞增殖的作用。 該次的研究在細胞水平驗證FGFR2 基因的過表達具有促進細胞生長的作用， 說明FGFR2 基因的過表達與ICC 發展有密切關系， 而且其發揮作用的機制可能與FGFR2 信號通路的激活有關。

綜上所述，FGFR2 基因的過表達具有促進正常細胞和人膽管癌細胞增殖的作用， 但其具體作用機制還需進一步的研究。 該次研究結果為FGFR2 基因在ICC發揮作用及作用機制的研究奠定了一定的基礎。