基于生物信息學楝酰胺A 抑制Jurkat 細胞增殖的機制

辛曉麗玄 敏劉苓霜?徐振曄?

（1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科，上海200030； 2.山東省青島市第八人民醫院藥學部，山東 青島266000）

急性T 淋巴細胞白血病是T 細胞在骨髓內惡性增殖、抑制正常造血功能的血液系統惡性腫瘤，骨髓中可見20%以上的原始淋巴細胞和部分幼稚細胞。急性T 淋巴細胞白血病發病占兒童急性淋巴細胞白血病的10%～15%，占成人急性淋巴細胞白血病的25%［1-2］，發病初期白細胞計數升高，可見中樞神經系統浸潤和淋巴結、肝、脾腫大，部分患者骨關節及胸骨中下段壓痛，大多數患者預后不良［3］。目前多采用化療和造血干細胞移植的方法治療急性T 淋巴細胞白血病，但患者對化療藥物敏感性不夠、耐藥性的產生及誘導緩解的失敗，以及骨髓微小殘留病灶清除緩慢，易導致急性T 淋巴細胞白血病在中樞神經系統的早期復發，影響預后［4］。因此，迫切需要對急性T 淋巴細胞白血病患者實行有效的治療和預后監測。楝酰胺A 是從西雙版納抗癌中藥米仔蘭中提取的環戊四氫苯并呋喃類化合物［5］。Neumann 等［6］采用楝酰胺A 干預人T 細胞淋巴瘤細胞株Jurkat 細胞和正常T 淋巴細胞，取細胞進行mRNA 芯片檢測，發現楝酰胺A 通過激活Jurkat 細胞ATM／ATRChk1／Chk2 通路，磷酸化Cdc25 A，使Jurkat 細胞阻滯在G1／S 期，抑制細胞增殖；對正常T 細胞的增殖抑制作用不明顯。本研究通過在高通量基因表達數據庫下載該芯片的數據集GSE41072 進行生物信息學分析，篩選差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs）后 進 行GO 分析、KEGG 通路分析和蛋白質-蛋白質相互作用（Proteinprotein interaction，PPI）分析。通過分析DEGs 的生物功能和通路，以了解楝酰胺A 抑制Jurkat 細胞增殖過程中的分子水平機制，進而為白血病的治療提供可能的作用靶點，闡明中藥提取物楝酰胺A 抗白血病的可能生物學機制。

1 資料和方法

1.1 基因芯片數據獲取 從美國國立生物技術信息中心的GEO 數據庫檢索并下載Neumann 等構建的楝酰胺A 干預人T 細胞淋巴瘤細胞株Jurkat 細胞基因表達微陣列芯片數據集GSE41072?；蛐酒畔⑵脚_為GPL6883 Illumina HumanRef-8 v3.0 expression beadchip 人類表達譜芯片，每個陣列上有24 526 個探針。該數據集共40 個樣品，由Neumann等［6］選取人T 細胞淋巴瘤細胞株Jurkat 細胞和人T 淋巴細胞，采用濃度為50 nmol／L 的楝酰胺A 進行干預，并設相應的非干預對照組，設不同時間點收集各組細胞，通過基因芯片對Jurkat 細胞和人T 淋巴細胞的基因表達進行系統分析。考慮該實驗證明楝酰胺A 對正常T 淋巴細胞增殖抑制作用不明顯，取樣時間點較多，故本研究選取Jurkat 細胞的24 個樣品進行研究，其中18 個為楝酰胺A 干預組，與對照組進行比較。

1.2 數據處理及DEGs 篩選 將GSE41072 的原始數據進行RMA 分析和背景矯正后，進行歸一化處理，匯總以獲取基因表達水平數據［7］。采用在線基因芯片數據分析軟件Morpheus（http：／ ／software.broadinstitute.org／morpheus）對楝酰胺A 干預組與對照組細胞的基因微陣列表達譜進行差異表達分析，采用配對樣本t 檢驗和倍比法識別DEGs，篩選同時滿足｜lgFC ｜＞1.00 和P＜0.05 的DEGs。

1.3 富集分析 將篩選得到的DEGs 輸入在線數據庫DAVID（https：／ ／david.ncifcrf.gov）進行 GO 分析和KEGG 通路分析，篩選滿足P＜0.05 的結果，得出與楝酰胺A 干預作用相關的功能富集基因和關鍵信號通路。

1.4 毒性機制相關基因蛋白互作網絡構建及分析 相互作用基因庫檢索工具（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，STRING）數據庫包含已知和預測的蛋白質相互作用，通過對蛋白質相互作用可能程度進行打分，評價其可能性的大小。將與楝酰胺A 干預作用相關的DEGs 用DAIVD 網絡數據庫進行基因名稱轉換，輸入STRING 10.0 數據庫（http：／ ／string-db.org），將蛋白互作結果采用Cytoscape 軟件進行PPI 網絡分析及MCODE 子網絡聚類分析，得到具有較高節點度（Degree）的中心蛋白。

2 結果

2.1 DEGs 篩選結果 GSE41072 基因表達微陣列芯片數據集中，涉及Jurkat 細胞的樣品共24 個，其中對照組6 個，楝酰胺A 干預組18 個。DEGs 篩選結果顯示，共有122 個刺激反應相關DEGs 被選出，其中上調基因98 個，下調基因24 個（圖1）。圖1 是基因表達水平變化最明顯得DEGs的部分表達熱圖。

圖1 DEGs 表達熱圖（部分）

2.2 GO 功能分析結果 差異表達基因GO 功能分析結果生物過程、細胞組分和分子功能三大部分，其中生物過程和分子功能部分結果差異有統計學意義。生物過程部分中，P值最小的前5 個基因功能富集為細胞生長調節、細胞大小相關功能，合計基因數量占61.8%；分子功能包括信號傳感器激活、端粒DNA 結合、受體結合、高分子復合物結合和肌動蛋白纖維結合。見表1、表2。

表1 GO 功能分析結果（生物過程）

表2 GO 功能分析結果（分子功能）

2.3 KEGG 通路分析結果 共有2 個通路符合P＜0.05 的閾值要求，被顯著富集。與楝酰胺A 干預Jurkat 細胞相關的信號通路，Ras 相關蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）信號通路和過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）信號通路，見表3。其中，DEGs 富集最多、最顯著的是Rap1 信號通路，說明Rap1 信號通路在楝酰胺A 抑制Jurkat 細胞增殖中起關鍵作用。楝酰胺A 干預后，DEGs 在Rap1 信號通路中的富集情況見圖2，其中五角星標注的基因為表達變化的DEGs。

表3 KEGG 通路富集結果

圖2 DEGs 在Rap1 信號通路中的富集情況

2.4 PPI 網絡構建 PPI 網絡包括代表蛋白質的節點和代表蛋白相互作用的邊，單個節點所連接的邊的個數稱為節點的度，中心蛋白是具有較高節點度的蛋白［8］。節點度最高的10 個中心蛋白編碼基因分別為表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子（VEGFA）、G 蛋白亞單位γ轉導素2（GNGT2）、過氧化物酶體增殖因子激活受體γ（PPARG）、核仁素（NCL）、G 蛋白亞單位 αO1（GNAO1）、大麻素受體1（CNR1）、X-射線修復交叉互補蛋白5（XRCC5）、G 蛋白偶聯雌激素受體1（GPER1）、鞘氨醇-1-磷酸受體3（S1PR3），其中，節點度最高的中心蛋白編碼基因為EGFR，說明EGFR 基因在楝酰胺A 抑制Jurkat 細胞增殖中起關鍵作用。見圖3、表4。

圖3 PPI 網絡互作分析結果圖

表4 PPI 網絡具有較高節點度的前10 位中心蛋白編碼基因

3 討論

楝科米仔蘭屬植物主要分布在中國南部、印度、越南、斯里蘭卡、馬來西亞、澳大利亞等地，多為直立喬木、灌木，共130 余種。該屬許多種的根、莖、葉、果實均可入藥，被當地居民用于治療發熱、頭暈、咳嗽、哮喘及皮膚炎癥等［9］。米仔蘭（Agaia odorata lour.）其花味甘、辛，功效行氣解郁，主治氣郁胸悶、食滯腹脹，亦可提取芳香油作為香料；其葉味辛，性微溫，功效活血化瘀、消腫止痛，主治跌打、骨折和癰疽?！稄V西藥植名錄》 記載：“枝葉：治跌打，疽瘡”。楝酰胺A 是從米仔蘭中提取的具有抗癌活性的環戊四氫苯并呋喃類化合物［10］。Ming 等［11］最早從米仔蘭中分離出楝酰胺A，并發現其可以延長白血病癌細胞荷瘤小鼠的生存時間。1997 年，研究者已發現楝酰胺A 具有抑制腫瘤細胞增殖的功能，但機制尚未闡明［12］。之后研究者通過細胞實驗發現，楝酰胺A 可通過抑制MEK-ERKMnk1 信號通路，調節蛋白質的合成，抑制細胞增殖和腫瘤的生長［13］。Polier 等［14］通過進一步研究發現，楝酰胺A 的直接作用靶點是PHB，通過與PHB 結合，抑制PHB 與CRaf 的相互作用，從而抑制Raf-MEK-ERK 信號通路，發揮抑制細胞增殖的作用。

EGFR定位于人類染色體7p12-7p13 位置，是表皮生長因子受體（HER）家族成員，該家族成員包括HER1、HER2、HER3、HER4，其中，HER1 即為EGFR（或稱為erbB1）。EGFR 編碼的蛋白質具有酪氨酸激酶活性，是跨膜的受體型酪氨酸蛋白激酶之一，與EGF 識別并結合，通過自身磷酸化來激活下游多條信號通路，涉及細胞的增殖、遷移、分化等多個生物學過程，與細胞的惡性轉化密切相關［15］。EGFR 在肺癌、結腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均存在過表達的現象，已成為腫瘤靶向治療的經典靶點，其經典的信號通路包括Ras-MAPK 和PI3K-Akt-mTOR 通路，兩者均與細胞增殖有關。目前，對EGFR 在血液系統疾病中的研究較少。劉曉亮等［16］采用黃芩提取物單體SBX 干預白血病細胞系HL-60 細胞發現，黃芩提取物單體SBX 通過影響EGFR、MAPK 信號通路，將細胞周期阻滯在G0 ／G1期，發揮細胞增殖抑制作用。何玲等［17］通過酶聯免疫法檢測急性髓性白血病患者血清p53 和EGFR 表達水平發現，患者血清中EGFR 呈高表達，說明EGFR 可能與急性髓性白血病的發生發展存在密切聯系。此外，臨床用于治療非小細胞肺癌的厄洛替尼（EGFR-TKI）能夠誘導急性髓細胞性白血病細胞系中原始細胞的凋亡，與雜氮胞苷合用時阻滯細胞周期進展并誘導細胞凋亡，對骨髓增生異常綜合征具有一定的治療效果［18-19］。本研究通過GO 功能分析結果表明，楝酰胺A 具有抑制人T 細胞淋巴瘤細胞株Jurkat 細胞增殖的作用；結合KEGG 分析和PPI 網絡互作分析結果，證明Rap1 信號通路及EGFR 基因在楝酰胺A 抑制Jurkat 細胞增殖中起關鍵作用。如圖2 所示，腫瘤細胞通過分泌轉化生長因子、表皮生長因子等，激活RTK（如EGFR、VEGFR 等），進而激活Crk、C3G，使未活化的Rap1-GDP磷酸化生成Rap1-GTP，激活MAPK 信號通路及PI3K-Akt信號通路，促進腫瘤細胞生長和增殖；此外，Rap1 的活化可促進肌動蛋白細胞骨架調控、細胞黏附相關信號通路，促進腫瘤細胞的黏附、遷移。PPI 網絡互作分析表明，楝酰胺A 可通過下調EGFR、VEGFA 的表達，使Rap1 活化水平降低，可能影響MAPK 信號通路或PI3K-Akt 信號通路的激活，從而發揮抑制Jurkat 細胞增殖的作用。研究表明，表阿霉素誘導Jurkat 細胞凋亡與PI3K-Akt-mTOR 信號通路的活化有關［20］，與本研究結果一致。

綜上所述，本研究通過對Jurkat 細胞基因表達微陣列芯片數據集GSE41072 進行生物信息學分析，共篩選出122個差異表達基因，其中表達上調的基因98 個，表達下調的基因24 個。GO 基因功能分布結果顯示，DEGs 多集中于細胞增殖及其調控相關功能基因；KEGG 通路分析結果顯示，Rap1 信號通路和過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）信號通路被顯著富集，DEGs 富集最多、最顯著的是Rap1信號通路。PPI 網絡分析篩選出節點度最高的前10 個中心蛋白編碼基因是EGFR、VEGFA 等，其中EGFR 節點度最高。提示楝酰胺A 抗T 細胞淋巴瘤白血病的機制與Rap1 信號通路及其下游的MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等有關，EGFR 可能是其關鍵的作用靶點。