近紅外光譜技術在金銀花和山銀花判別中的應用研究△

劉征輝，魏靜娜，趙琳琳，趙云平，薛天凱，黃迪，郭永澤，程奕*

1.天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381；2.天津海世達檢測技術有限公司，天津 300381；3.天津市現代中藥質量檢驗中心，天津 300381

金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]，主產于河北、山東、河南等北方多省；山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq.、華南忍冬L.confusaDC.和黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsuet S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花[1]，主產于四川、重慶、貴州、湖南、廣東等南方多省。金銀花和山銀花為同科異種植物的干燥花蕾，具有清熱解毒、疏散風熱的功能，主治癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等病癥，但兩者在藥用歷史、來源、性狀、化學成分等方面的存在差異。北方金銀花產量低價格高，南方山銀花產量高而價格低，造成了金銀花和山銀花市場混亂，“雙花”之爭愈演愈烈。為了更好地對金銀花和山銀花進行開發利用、解決兩者之爭，本研究就金銀花和山銀花的近紅外指紋圖譜技術對其識別控制問題進行探討。

中藥材指紋圖譜是一種對中藥質量進行評價的切實可行的方法[2-3]，對金銀花藥材的指紋圖譜研究主要依靠液相色譜和液質聯用技術。近紅外光(NIR)是介于紫外可見光和中紅外光之間的電磁波，其波長為4000～12 000 cm。NIR區域主要反映了中紅外區域含H基團的倍頻和組合頻吸收，因此，這一波段非常適合有機化合物的理化參數測定。NIR光譜儀擁有多種檢測終端，如光線探頭、液體流通池、積分球等，可以采用透射、反射等檢測方法進行鑒定[4-5]。NIR測定對樣品要求簡單，可以直接測定，且測定速度快，結果可靠，近些年來已有大量文獻關于近紅外在中藥質量控制方面的研究[6-9]。

本研究首先利用《中華人民共和國藥典》方法對來自不同產地的金銀花樣品進行鑒定，并結合UPLC-Q/TOF進行進一步分析。并比較了UPLC提供的色譜信息與NIR提供的光譜信息的聚類分析結果，經過色譜峰提取，波段選擇標準化預處理，主成分分析等手段得到了基本一致的鑒別分類結果，為近紅外技術在金銀花品質鑒別中的應用提供了前期研究基礎[10-14]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

近紅外光譜儀(Tensor 37，德國Bruker公司)；萬分之一電子天平(METTLER AB54)。要求室內溫度(25±2) ℃，相對濕度45%～55%。

金銀花樣品來源見表1。每個樣品經過粉碎機粉碎并過80目篩，取約1 g(誤差控制在5%以內)，裝入10 cm石英杯中，待測。以鍍金面板為背景，分辨率8 cm-1，掃描平均數32，波長為12 500～4000 cm。掃描3次，取其平均值作為NIR光譜。

1.2 樣本采集

通過對金銀花和山銀花主產區及藥材市場進行調研，獲得具有一定代表性的樣本101份。其中金銀花樣品收集自河北巨鹿縣、河南封丘縣、山東平邑縣等地。見表1。

表1 金銀花和山銀花樣品信息

續表1

續表1

注：1～69為金銀花；70～101為山銀花。

2 方法與結果

2.1 近紅外技術的原理

近紅外光譜分析是根據近紅外譜區化合物含C-H、S-H、C=O等基團振動頻率被吸收產生生產的光譜而進行的分析。近紅外譜區的吸收基于不同的分子與振動頻率，這意味著每個分子將對應于特征紅外吸收光譜的結構特征，這是紅外光譜的定性分析的物理基礎。20世紀末，現代近紅外光譜分析技術在測試領域，尤其是作為在線分析和工業控制領域重要性日漸明顯，主要應用于中藥種質鑒定、品質分析、功能性成分分析等多個相關學科領域[15-16]。

2.2 近紅外技術的主要特點及應用

近紅外光譜技術的優勢在于：分析速度快，測量過程1～2 min內就可以快速完成，便于實現在線分析；適用范圍廣，能夠對固體粉末、液體等不同狀態的樣品直接進行測試，并且不需損耗樣品，屬于無損檢測范疇；重復性較好，測量時不需要化學試劑等條件，也不需要繁雜的預處理，節約成本無污染；分析效率高，通過光譜測試建立相應的校正模型，能夠實現對樣本中多個組分進行同時測定，并提供準確度相當高的分析結果。正是基于近紅外漫反射技術的以上優勢，近些年來在石化、農業、煙草、食品和醫藥等領域廣泛得到了應用[17]。

2.3 多元變量統計分析軟件(SIMCA)模式識別法

模式識別是基于“物以類聚”分類的原則，目前的方法主要應用于線性學習機法、馬氏距離法、均值方法及SIMCA等其他方法。基于主成分分析(PCA)的SIMCA模式識別法操作：首先，對光譜測試數據進行PCA分析，建立PCA校正模型；然后，通過計算驗證樣本距校正模型的距離，找到最小距離的類。PCA主要是將大量光譜數據通過降維轉化為少數綜合指標的方法。

2.4 不同光譜預處理對主成分分析的影響

原始NIR光譜不僅包含樣品有效成分方面有關的信息，尚還包含由環境和儀器等外界因素的噪音，噪音在一定程度上不利于模型的建立。而光譜預處理是可以有效減少或消除噪音，通常使用的有基線校正、平滑、歸一化、求導等光譜預處理方法。此外，不同的活性成分之間的相互干擾，也可引起近紅外譜線重疊，通過數據推導方法可以減少光譜重疊的負面影響。在這個實驗中，分別采用了多元散射校正、標準變量變換、一階導數和二階導數4種預處理方法，結果顯示，用一階導數預處理光譜圖可以消除固體顆粒散射造成的基線漂移，在對所有樣本進行主成分分析時可以明顯將金銀花與山銀花區分開，故本實驗最終選用了一階導數作為預處理方法。通過對金銀花和山銀花2類樣本的一階導數處理光譜數據進行主成分分析，分別得到用于SIMCA判別分析的PCA模型。

本研究首先將101個樣品的光譜數據進行PCA分析，分別建立原始光譜、多元散射校正、標準變量變換、一階導數和二階導數預處理后的主成分分析模型，波數范圍選擇5300～5550、6900～7500、8200～12 000 cm-1，因為此波數段下的光譜在一階導數和二階導數下的波動噪音更小。圖1～5為5種光譜預處理效果圖。由于本實驗選用的是一階導數作為預處理方法，圖6為一階導數預處理光譜后經主成分分析得到的得分圖，圖中藍色為金銀花樣品，紅色為山銀花樣品。結果顯示，金銀花樣本聚集在一起，而山銀花樣本也聚集在一起，二者得到了明顯分離。

圖1 金銀花和山銀花樣本近紅外原始光譜

圖2 金銀花和山銀花樣本多元散射校正圖譜

圖3 金銀花和山銀花樣本標準變量變換圖譜

圖4 金銀花和山銀花樣本一階導數光譜

圖5 金銀花和山銀花樣本二階導數光譜

SIMCA方法判別結果的特征只有是或者否。建模樣品的類別分為金銀花和山銀花2類，因此，SIMCA方法可用于確定是金銀花還是山銀花。在整體主成分分析的基礎上可以將金銀花和山銀花得到很好的區分，這表明用SIMCA模式識別法檢測金銀花與山銀花的差異具有可行性。

圖6 金銀花和山銀花樣本一階導數后主成分分析聚類效果

2.5 應用SIMCA算法區分金銀花與山銀花的差異性

所有樣品均隨機抽取約75%樣本(76個)用于構建SIMCA判別模型中，約25%的樣品(25個)作為驗證樣本集的建模效果評價。建模樣品為：金銀花樣本51個編號分別為1～4、11～19、26～49、56～69；山銀花樣本25個編號分別為70～77、85～101。模型建立與主成分分析確定的建模波數為：5304～4000、6905～5555、8205～7507 cm-1，分別提取這些近紅外光譜數據，通過一階導數光譜預處理交互驗證優選6個主成分。從圖7中可以看出，這些金銀花和山銀花分別有明顯的聚類趨勢，因此本研究在主成分分析的基礎上，分別對金銀花和山銀花樣品中隨機挑選金銀花樣本(5～10、20～25、50～55)和山銀花(78～84)樣本作為驗證集，用來檢驗模型的可靠性。當所有樣本以金銀花主成分為投影模型時，得到效果圖8，可見金銀花樣本集中性高；當所有樣本以山銀花主成分為投影模型時，得到效果圖9，可見山銀花樣本集中性較低但也可以同金銀花樣本區分開，這主要是由于山銀花還具體分為紅腺忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬及灰氈毛忍冬不同種屬。

注：藍色為建模用的金銀花樣品；紅色為建模用的山銀花樣品；綠色為驗證模型用的樣品。圖7 SIMCA算法的聚類總趨勢圖

注：藍色為驗證用的金銀花樣品；紅色為驗證用的山銀花樣品。圖8 驗證集投影到金銀花組的驗證效果圖

注：藍色為驗證用的金銀花樣品；紅色為驗證用的山銀花樣品。圖9 驗證集投影到山銀花組的驗證效果圖

3 討論

本研究驗證樣本25個：其中18個金銀花樣本編號分別為5～10、20～25、50～55；7個山銀花樣本編號分別為78～84。聚類結果：16個金銀花和6個山銀花被完全區分開，2個金銀花樣本發生干涉，1個山銀花樣本未知分組。金銀花和山銀花有效成分種類和含量均有所不同，故在近紅外光譜上有一定差異，所表現在模型圖上有一定的距離。另外環境、氣候、土壤、水分及加工炮制工藝等外在條件，這些也會對藥材內部品質產生相應的影響。從以上的分析中也就可以推斷：4種山銀花品質相對一致，與金銀花相差最大。

本實驗利用近紅外光譜方法識別了金銀花和山銀花的差異性，在主成分分析的基礎上利用SIMCA模式識別原理對金銀花和山銀花分別建立了類模型，模型基本能正確識別金銀花和山銀花，結論充分表明了近紅外光譜結合SIMCA模式識別方法在金銀花和山銀花分類識別中的可行性。由于金銀花、山銀花樣本受到產地和炮制工藝的影響，內部有效成分將會有不同程度的變化也要適當考慮。實驗所選用的101批金銀花樣品，綠原酸、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷含量覆蓋范圍廣，且分布比較均勻，具有一定的代表性。主成分分析的聚類效果可以將金銀花和山銀花區分開，聚類結果可以和SPSS結果互相印證。

綜上所述，結合《中華人民共和國藥典》傳統檢測方法以及近紅外分析技術，對金銀花的真偽鑒別提供了新的思路。近紅外分析技術具有簡便快捷的優勢，可以代替傳統化學和HPLC分析進行快速排查，結合藥效成分的定量分析采用HPLC以及近紅外技術對金銀花品質的分析還有待進一步探索。