紫杉醇靶向Hippo信號通路抑制食管鱗癌干細胞干性的機制研究

宿偉鵬 張 洋 張宋安 劉 攀 趙化榮

食管癌(esophageal carcinoma, EC)病死率位居惡性腫瘤第6位，是世界第八大常見惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為15%～25%[1]。主要表型分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)及食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，其中ESCC多發于中國及亞太其他地區，年發生率超過40萬例，占總發生率的90%[2]。目前常用治療手段有內鏡下切除治療、外科手術、放射治療(以下簡稱放療)及化學治療(以下簡稱化療)等，其中化療方案中常用紫杉醇(paclitaxel, PTX)配合治療方案。紫杉醇是由紅豆杉樹皮中分離提純的具有良好抗腫瘤效果的天然次生代謝產物，是繼阿霉素和順鉑后最有效的廣譜抗癌藥物，可作用于微管，抑制細胞有絲分裂，破壞細胞周期，被廣泛應用于治療食管癌、頭頸癌、乳腺癌、肺癌等諸多惡性腫瘤[3～5]。另一方面，近年來腫瘤干細胞學的新興提示腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)可能是腫瘤化療抵抗的根本原因，而紫杉醇對食管癌腫瘤干細胞的作用及機制未見闡明[6,7]。因此，本研究旨在通過分離食管鱗癌干細胞(ESCC-CSCs)，通過紫杉醇誘導，進一步探究紫杉醇對ESCC-CSCs細胞干性的作用及其作用機制。

材料與方法

1.材料:人食管癌細胞TE-13細胞系(ATCC)；PBS、胰蛋白酶、胎牛血清和1640培養基(美國Hyclone公司)；Hoechst33342、碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液、維拉帕米(中國碧云天公司)；CD44、SOX2免疫熒光抗體(CST)；紫杉醇(2mg/ml，大連美侖生物公司)；CCK-8試劑盒(美國AbMole公司)；B27(美國Invitrogen公司)；人重組表皮因子、堿性成纖維上皮生長因子、肝素(美國Sigma-Aldrich公司)；胰島素(400U/支，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司)；TRIzol、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白Marker(中國碧云天公司)；p-TAZ、TAZ、CD44、SOX2多克隆抗體、IgG(美國Santa cruz公司)；PCR檢測引物由金斯瑞生物科技有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.ESCC-CSCs細胞的分離、培養與鑒定:(1)ESCC-CSCs細胞的分離及培養:以人食管鱗癌細胞系TE-13細胞常規培養于含10%胎牛血清的1640培養基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中，培養2～3代后取對數生長期細胞2×106個/毫升單細胞懸液，分別加入6μg/ml Hoechst33342、100mmol/L維拉帕米，室溫孵育90min，染色結束后迅速轉移細胞至4℃冰上終止染色。離心沉淀細胞，FACS緩沖液重懸細胞至1×107個/毫升，加入2μg/ml PI后過400目濾網上流式細胞儀參照側群細胞(side population cells, SP細胞)的分離分選方法，測量前向散射和側向散射參數[8]。以Hoechst red為X軸，Hoechst blue為Y軸做二維散點圖，取低Hoechst red/blue及維拉帕米缺失的區域為目標SP細胞，即ESCC-CSCs，收集分選出的SP細胞常規培養傳代，進行后續實驗。(2)ESCC-CSCs細胞鑒定:取2～4代ESCC-CSCs細胞消化重懸后均勻滴加在共聚焦專用皿底部中央，待細胞貼壁生長至50%密度后棄培養基，冰PBS洗滌細胞2次，分別避光加入CD44抗體(FITC標記)和SOX2抗體(藻紅蛋白標記)與Hoechst33342共染色30min，棄染液，4%多聚甲醛固定細胞后上機觀察并采集照片。(3)分組及處理:實驗分為兩組：空白對照組(NC)及實驗組(PTX)，空白對照組ESCC-CSCs細胞不做任何處理，實驗組細胞依據實驗需要加入終濃度為1.25μg/ml的紫杉醇處理，收集處理后的各組細胞進行后續實驗。

3.CCK-8:收集處于對數生長期的ESCC-CSCs細胞，消化離心后重懸至5×104個/毫升接種至96孔板中，每孔接種100μl，實驗組細胞培養基中含1.25μg/ml的紫杉醇，常規培養0、24、48、72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃培養箱中孵化4h，上酶標儀檢測各孔細胞在450nm處的吸光度(A)值。每組5個副孔，取平均值。

4.克隆形成實驗:ESCC-CSCs細胞經紫杉醇處理誘導48h后，消化收集2組細胞，重懸調整細胞密度至1×103個/孔，充分吹打至單個細胞后將細胞懸液接種至預熱的含10ml 1640培養基的100mm培養皿中，輕輕搖動分散細胞，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中靜置培養3周。棄培養基，用冰PBS潤洗培養皿3次，加入4ml 4%多聚甲醛固定液固定細胞克隆，移除固定液，加入適量1%結晶紫染色液避光染色30min，染色結束后用冰PBS反復緩慢沖洗培養皿至PBS不再變色，棄去PBS，室溫晾干后觀察并記錄克隆形成數目。

5.干細胞成球實驗:1640完全培養基中加入B27(1∶50)、20ng/ml人重組表皮因子、20ng/ml堿性成纖維上皮生長因子、40g/ml肝素及50g/ml胰島素配置成干細胞培養基。ESCC-CSCs細胞經紫杉醇處理誘導48h后，消化收集兩組細胞，以5×103個/孔密度接種于低黏附6孔板內，加入干細胞培養基常規培養，培養10天后，顯微鏡下觀察并采集圖像，記錄每孔中直徑>75μm的細胞球個數(a)，計算細胞球形成效率(sphere formation efficiency, SFE)，SFE(%)=(a/接種細胞總數)×100%。

6.Western blot法檢測相關蛋白表達:將各組處理后的單層生長的細胞用冰PBS緩慢沖洗2次，加入含1%PMSF的RIPA裂解液1ml至覆蓋全部培養板，置于冰上孵育30min，用細胞刮將帖壁細胞刮下轉移至1.5ml EP管中，4℃12000r/min離心20min取上清。經BCA蛋白定量試劑盒定量后，各取50mg蛋白加入等體積1×SDS上樣緩沖液，沸水浴10min變性蛋白質。行10%SDS-PAGE電泳，電泳結束后將上述蛋白轉移至PVDF膜，抗體孵育后檢測目的蛋白條帶表達情況。

7.Real-time PCR檢測相關mRNA表達:收集經紫杉醇誘導處理48h后的ESCC-CSCs細胞及對照組細胞，參照TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNAs，以GAPDH作為內參基因使用qRT-PCR試劑盒對待測mRNA進行定量擴增。PCR反應體系25μl，預設PCR反應條件為94℃預變性2min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，設置40次循環；擴增結束后設置95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s做溶解曲線。采用2-ΔΔCt相對定量分析方法檢測細胞中相關mRNA表達水平。實驗過程中每組樣本配置3個副孔，取平均值記錄分析，同時做陰性對照排除反應體系中PCR污染及引物二聚體干擾。

8.統計學方法:采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行方差分析，并進行兩兩比較。所有細胞功能實驗均重復3次，取平均值后進行數據分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 ESCC-CSCs的分離及鑒定(熒光染色，×200)A、B.TE-13細胞系經熒光活化細胞分選：A.采用Hoechst33342標記分選的TE-13細胞中SP細胞約占29.3%；B.SP細胞與維拉帕米共孵育后，細胞所占比例降至1.3%；C～E.Hoechst與SOX2同時對分選出的細胞染色圖像采集及組合；F～H.Hoechst與CD44同時對分選出的細胞染色圖像采集及組合

結 果

1.ESCC-CSCs分選與鑒定:通過流式分選TE-13細胞中SP細胞群，如圖1A、B所示，排除死細胞和細胞碎片，基于散射信號及PI熒光，篩選到SP細胞占總細胞數的29.3%；同時細胞與維拉帕米共孵育后，SP細胞所占比例僅為1.3%，由此說明細胞對Hoechst33342的排除是由維拉帕米敏感導致的。進一步通過免疫熒光染色鑒定分選所得細胞，Hoechst染色確定細胞核位置呈藍色熒光，潛在的食管鱗癌干細胞特異性標志物CD44及SOX2用于表征ESCC-CSCs干細胞特性，CD44抗體呈綠色熒光，SOX2抗體呈紅色熒光，同一視野下拍攝并組合Hoechst與二者熒光圖片。如圖1C～H所示，分選的SP細胞均表達SOX2及CD44，可以判斷ESCC-CSCs細胞提取成功。

2.紫杉醇抑制ESCC-CSCs細胞增殖:CCK-8檢測紫杉醇對ESCC-CSCs細胞體外增殖能力的影響，如圖2所示，體外給予紫杉醇處理24h后，實驗組較對照組細胞體外增殖能力開始受到顯著抑制(P<0.01)，且隨時間的增加，紫杉醇對ESCC-CSCs細胞增殖能力的抑制增強，與對照組比較，差異有統計學意義(P=0.000)。

圖2 CCK-8檢測紫杉醇對ESCC-CSCs體外增殖活力的影響與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000

3.紫杉醇抑制ESCC-CSCs細胞克隆形成及體外成球:克隆形成實驗進一步說明紫杉醇可以抑制ESCC-CSCs細胞體外增殖及克隆形成能力，如圖3A～C所示，給予紫杉醇誘導后細胞體外增殖干性顯著降低，克隆形成數量較對照組顯著減少(P<0.01)；成球實驗結果表明，在經紫杉醇處理后ESCC-CSCs細胞成球率SFE顯著低于對照組細胞(P<0.01)，且觀察到球體直徑明顯小于對照組細胞球，如圖3D～F所示，由此說明紫杉醇抑制ESCC-CSCs細胞體外成球及自我更新能力。

圖3 紫杉醇對ESCC-CSCs細胞克隆形成及體外成球能力的影響(×40)A～C.克隆形成檢測對照組(A)和實驗組(B)體外克隆形成情況及定量統計結果(C)；D～F.成球實驗檢測對照組(D)和實驗組(E)體外干細胞成球能力及各組體外SFE統計結果(F)

4.紫杉醇抑制ESCC-CSCs細胞內TAZ、CD44、SOX2關鍵蛋白表達:Western blot法檢測細胞內相關蛋白表達變化，如圖4A、B所示，給予紫杉醇作用后ESCC-CSCs細胞內TAZ、CD44、SOX2蛋白表達水平顯著降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P=0.000)，反之磷酸化的TAZ(p-TAZ)較對照組蛋白表達量顯著增加；qRT-PCR檢測細胞內相關mRNA分子變化情況，如圖4C顯示，紫杉醇可顯著抑制ESCC-CSCs細胞內CD44及SOX2 mRNA表達(P=0.000)，而對TAZ mRNA表達無顯著影響。

圖4 紫杉醇對ESCC-CSCs細胞內TAZ、CD44、SOX2等關鍵蛋白及mRNA表達的影響A、B.Western blot法檢測ESCC-CSCs細胞內相關蛋白表達水平(A)及定量分析結果(B)；C.細胞內相關mRNA表達水平檢測；與對照組比較，*P=0.000

討 論

腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤中一群與正常組織干細胞具有相似功能，且具有長期自我更新及分化為子代細胞能力的細胞亞群，具有無限增殖、自我更新、多向分化的潛能[9，10]。近年來研究表明，CSCs能抵抗常規的放療及化療，參與腫瘤的化療藥物耐藥等重要過程[11，12]。發現并識別多種腫瘤的干細胞及其作用機制為腫瘤的靶向治療提供了新的方向。Hippo信號通路最早被發現可以通過抑制增殖和促進凋亡參與調控器官大小，并且具有高度的保守性，在人類及多種生物中都能找到相似功能的成員[13]。另一方面，近年來的研究表明Hippo作為抑腫瘤信號同時參與調控乳腺癌、肝癌等多種腫瘤干細胞的干細胞性能維持及癌癥進程[14～16]。本研究旨在通過探究紫杉醇對ESCC-CSCs干細胞性能及相關Hippo信號分子變化，闡明紫杉醇干擾ESCC-CSCs細胞功能抑制食管癌的作用機制。

通過側群細胞分離法對TE-13細胞系中可能存在的干細胞進行篩選，如圖1所示，干細胞中含有的ABC轉運蛋白家族中ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2)可將干細胞中Hoechst染料泵出胞內。因此，基于散射信號及PI熒光選定低Hoechst red信號、低Hoechst blue信號區域。同時，將細胞與維拉帕米共孵育后，維拉帕米發揮ABC家族蛋白抑制劑的作用，阻斷由ABCG2引發的細胞外排Hoechst，選定維拉帕米缺失的區域，二者共同篩選得到SP細胞群，可認為是TE-13細胞系中具有干細胞特性的ESCC-CSCs細胞。進一步參考相關文獻報道，選取CD44、SOX2為ESCC-CSCs細胞特異性標志物，檢測篩選所得細胞中CD44、SOX2的表達，進一步確定所得ESCC-CSCs的干細胞特性[17，18]。通過體外給予紫杉醇誘導后，筆者分別從細胞增殖、克隆形成及成球實驗3個方面觀察到紫杉醇對ESCC-CSCs細胞干性存在顯著抑制(圖2、圖3)，為進一步探究紫杉醇抑制ESCC-CSCs干細胞特性的分子機制，分別從mRNA及蛋白水平對Hippo信號通路關鍵蛋白TZA、干性調控因子SOX2、CD44的表達水平進行了檢測，如圖4所示，結果顯示紫杉醇誘導細胞內TAZ、CD44及SOX2蛋白表達減少，同時p-TAZ表達增加，而TAZ mRNA表達不依賴紫杉醇誘導發生變化，CD44、SOX2 mRNA表達水平變化與蛋白表達變化一致，均受紫杉醇的抑制。

據相關文獻報道，CD44、SOX2高表達于正常的干細胞中參與調控細胞干性的維持[18]。紫杉醇誘導后，細胞分裂受阻相關CD44、SOX2 mRNA分子轉錄受到抑制，進一步造成了蛋白水平CD44、SOX2表達的降低。另一方面，TAZ蛋白減少與其mRNA表達無關，推測紫杉醇可能通過激活Hippo信號抑制TAZ的功能。相關研究表明，伐地那非等藥物可通過促進Hippo信號通路中MST和Lats的磷酸化進一步促進TAZ的S89位點的磷酸化，從而引起TAZ后續泛素化降解失活。因此，通過檢測ESCC-CSCs細胞中p-TAZ蛋白表達量的變化，發現給予紫杉醇誘導后ESCC-CSCs細胞中TAZ磷酸化程度增加(p-TAZ表達增加)，與TAZ表達呈負相關，這提示在食管癌中紫杉醇可能通過激活Hippo信號中MST和Lats蛋白激酶活化進一步促進TAZ磷酸化，抑制TAZ轉錄活性和生物學功能的作用，最終發揮抑制ESCC-CSCs細胞干性的作用。

綜上所述，筆者認為紫杉醇可通過作用于Hippo信號通路中TAZ、SOX2、CD44等關鍵分子蛋白，參與調控食管癌干細胞干性，抑制癌干細胞異常增殖和移植瘤的轉移，但與此同時，Hippo中涉及的多種復雜的分子信號機制是否參與紫杉醇對ESCC-CSCs細胞干性的調控仍有待于開展多方面的深入研究。