MXD3基因在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

梅 杰 徐 瑞 王惠宇 潘佳棟 劉超英

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，美國腫瘤協會預測2018年全美會有超過60000例RCC新增病例和近15000例死亡病例[1]。根據組織學特點和分析特征，RCC被分成許多亞型。主要亞型包括腎透明細胞癌(ccRCC)、腎乳頭狀細胞癌(pRCC)、腎嫌色細胞癌(chRCC)、腎集合管細胞癌(cdRCC)和未分類腎細胞癌[2, 3]。其中ccRCC是最常見的腎細胞癌亞型，約占70%～75%[2]。通常情況下RCC對傳統化療和放療療效不佳，最好的治療方法是早期外科切除[4]。然而，大量預后不良的ccRCC進展期患者仍然缺乏有效的治療措施來控制腫瘤惡性進展。因此，探索ccRCC潛在的生物學標志物和治療靶點對ccRCC的治療具有重要意義。

轉錄因子(transcription factors，TFs)被認為是細胞內基因表達的主要調控因子[5]。長期以來，關鍵TFs的失調被認為是多種腫瘤發生、發展的關鍵事件。MXD3是堿性-螺旋-環-螺旋轉錄因子MXD家族成員之一，與其輔因子MAX形成異二聚體，最初被認為是MXD/MAX/MYC轉錄網絡中MYC蛋白的功能拮抗劑[6～8]。MXD3在細胞增殖中發揮重要作用，有報道稱MXD3在多種腫瘤中表達失調，并且對少數腫瘤具有臨床診斷和治療價值。MXD3在髓母細胞瘤和神經母細胞瘤中均有高表達，在上述兩種腫瘤中均發揮致癌基因的作用[9, 10]。與之相反的是，在前列腺癌和神經纖維瘤病中，MXD3表達降低[10]。然而，盡管MXD3的表達就作用機制在少數幾種腫瘤中已有探究，關于MXD3在ccRCC中表達的研究尚未見報道，MXD3對ccRCC的潛在作用還存在很大的探索空間。

本研究中，筆者從癌癥基因組圖譜數據庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和基因表達匯編數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)下載ccRCC中MXD3表達數據和臨床病理參數，分析MXD3表達與腎透明細胞癌臨床病理學參數之間的相關性及對預后的影響。本研究首次揭示了MXD3在ccRCC中的差異表達及對預后的影響，有望成為ccRCC靶向治療的新靶點。

材料與方法

1.TCGA數據資料收集：利用UCSC Xena網站(https://xenabrowser.net/)下載腎透明細胞癌患者基因表達譜Level3數據和臨床隨訪資料。整理提取MXD3 mRNA表達數據以及相應的臨床資料，其中MXD3表達譜數據已進行lg2(x+1)標準化轉化。通過篩選，共保留528例同時包含MXD3表達譜數據與對應的臨床隨訪資料的病例信息，其中有72例腫瘤組織包含配對的正常組織的基因表達數據。根據MXD3表達量，對數據集中的樣本按照MXD3的標準化表達量進行由高到低排序，將數據兩等分，位于前50%的樣本為高表達組，位于后50%的樣本為低表達組。

2.GEO數據資料收集：登錄GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)數據庫，從數據集中下載ccRCC測序芯片集GSE40435，用于驗證ccRCC中MXD3 (ID_REF: ILMN_1711904)的差異表達。GSE40435由Wozniak等[11]在GPL10558平臺上使用Illumina HumanHT-12 v4表達串珠芯片獲得的ccRCC測序芯片集，包含101個腫瘤組織和與其匹配的正常組織的基因表達譜。

3.生存分析：采用Kaplan-Meier法對保留的528例患者的MXD3 mRNA表達數據與匹配的生存資料進行生存分析。使用COX比例風險模型對可能影響腎透明細胞癌患者預后的參數進行單因素和多因素分析，模型參數采用Omnibus檢驗法。

4.統計學方法：應用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行統計分析。采用配對t檢驗比較腫瘤組織和對應的癌旁正常組織中MXD3表達量。采用ROC曲線評價腫瘤組織和癌旁正常組織中MXD3差異表達的診斷意義。采用χ2檢驗比較MXD3表達量與臨床病理參數關聯性，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.MXD3在腎透明細胞癌中的表達：與癌旁組織比較，TCGA數據庫中ccRCC組織的MXD3表達均明顯上調(P=0.000，圖1A)。筆者進而使用ROC曲線法評估MXD3的差異表達在診斷ccRCC中的潛在價值(AUC=0.897，P=0.000，圖1B)，敏感度為83.33%，特異性為91.67%。筆者進一步利用GSE40435微陣列數據驗證了MXD3在ccRCC中的差異表達(P=0.000，圖1C)，同時也證明MXD3在ccRCC組織中的過表達對鑒別ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價值(AUC=0.785，P=0.000，圖1D)。

2.MXD3表達與ccRCC臨床病理變量的關系：因GSE40435微陣列數據未包含完整的臨床病理參數，本研究只納入了TCGA數據庫中的528例患者進行臨床病例參數和生存分析。按照MXD3表達量將患者分為MXD3高表達組和低表達組。MXD3表達在性別及年齡方面比較，差異無統計學意義(P=0.465，P=0.296，表1)。在ccRCC的臨床分期方面，MXD3表達在較大及發生遠端轉移的腫瘤中的表達顯著增加(P均=0.001)。TNM分期較高者MXD3表達也顯著增加(P=0.000)。然而，淋巴結轉移陽性患者MXD3表達情況與淋巴結轉移陰性患者比較，差異無統計學意義(P=0.213)。此外，MXD3高表達與病理分級密切相關(P=0.001)，詳見表1。

圖1 MXD3在ccRCC組織及癌旁組織中的表達A.TCGA數據顯示ccRCC組織中MXD3的表達明顯上調；B.TCGA數據集中MXD3 mRNA差異表達對ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價值；C.GSE40435微陣列數據顯示ccRCC組織中MXD3的表達明顯上調；D.GSE40435微陣列數據集中MXD3 mRNA差異表達對ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價值

3.MXD3表達與腎透明細胞癌患者生存的關系：與存活患者比較，死亡患者MXD3的表達明顯增加(P=0.000，圖2A)。Kaplan-Meier法分析顯示，MXD3高表達與ccRCC患者總體生存期縮短顯著相關(P=0.000，圖2B)。

表1 MXD3 mRNA表達量與腎透明細胞癌患者臨床病理學參數的關系

圖2 MXD3表達與ccRCC患者預后的關系A.存活患者與死亡患者MXD3表達比較差異有統計學意義；B.MXD3高表達的患者OS明顯短于MXD3低表達的患者

4.腎透明細胞癌患者的單因素和多因素生存分析：在總生存率預后因素的單因素COX回歸模型中，初診年齡(P=0.000)、T分期(P=0.000)、N分期(P=0.001)、M分期(P=0.000)、TNM分期(P=0.000)、腫瘤分化程度(P=0.000)、MXD3表達(P=0.000)均與患者預后相關(表1)。多因素COX分析顯示MXD3是OS的獨立預后因素(HR=2.249，95% CI: 1.350～3.488，P=0.000)。此外，年齡(P=0.008)和M分期(P=0.001)也是ccRCC患者的獨立預后指標(表2)。

表2 腎透明細胞癌患者的單因素和多因素生存分析

討 論

MXD3是MXD家族成員之一，參與調控MXD/MAX/MYC轉錄網絡，通過與MAX競爭性結合而阻斷依賴MYC基因轉錄的激活，被認為是一種腫瘤抑制因子。已有多項研究證實了MXDs與MYC相互作用的可能機制，MXDs的低表達或失活可導致MXDs-MAX二聚體的減少，從而使MYC的功能形式——MYC- MAX二聚體的數量顯著增加[12]。MYC編碼細胞核轉錄因子，在包括細胞增殖、生長、黏附、代謝、血管生成、分化和凋亡等真核細胞生物活動中發揮重要作用[13]。此外，大多數人類惡性腫瘤中都被發現存在MYC的表達失調，充當腫瘤發生、發展的致癌基因[14]。

MXD3在少數幾種腫瘤中已被確定為一種新的致癌基因，包括髓母細胞瘤、神經母細胞瘤以及急性B淋巴細胞白血病[9,10,15]。一項基于TCGA數據庫的研究表明膠質瘤過表達的MXD3受其轉錄組水平的可變剪接調控[16]。此外，以MXD3為靶點的靶向治療腫瘤的前景也十分可觀。MXD3 siRNA已被報道用于神經母細胞瘤和急性B淋巴細胞白血病的靶向治療，并對癌細胞的增殖有明顯抑制作用[10,17]。目前尚無相關研究報道MXD3在ccRCC中表達及臨床意義，因此本研究為較早地關注MXD3在ccRCC中的表達及其與臨床病理參數的關系。

通過對TCGA中MXD3表達數據的分析，筆者發現與癌旁組織比較，ccRCC組織中MXD3表達明顯上調。筆者采用ROC曲線評價MXD3對ccRCC的診斷價值，結果顯示相對敏感度為83.33%，特異性為91.67%。GSE40435微陣列數據集的MXD3表達數據進一步驗證了本研究結果，兩個獨立數據庫的結果均表明檢測MXD3 mRNA的差異表達是診斷ccRCC的有效方法。此外，MXD3表達量與ccRCC的TNM分期有關，在不同分化程度的腫瘤中差異有統計學意義。上述結果表明，MXD3表達可作為預測ccRCC進展的可靠指標。迄今為止，對于MXD3對人類惡性腫瘤的預后價值還知之甚少。筆者發現MXD3高表達組患者的OS明顯低于低表達組。單因素和多因素COX回歸分析表明，MXD3表達可作為ccRCC的獨立預測因子。

本研究初步分析MXD3表達及其與臨床病例參數的關系，表明MXD3表達的上調是ccRCC潛在的生物學標志物和獨立的預后指標。同時，MXD3可能成為一個新的抗癌治療靶點，可能改善ccRCC患者的預后。雖然本研究已經初步證明MXD3是一種新的ccRCC診斷和預后標志物，但本研究也存在一些局限性。主要的缺點是TCGA和GEO數據庫只提供了MXD3在mRNA水平上的表達，這或許不能完全代表MXD3在蛋白水平上的表達及活化程度。MXD3參與ccRCC發生、發展的可能機制還有待于進一步研究。