維生素D3對自發高血壓大鼠主動脈環血管內皮依賴的收縮及舒張的影響機制研究

屈 晨 祝 巖

高血壓是導致心腦血管疾病發生、發展的重要因素之一。高血壓會損害血管內皮的功能, 同時血管內皮的功能障礙反之也會加重并惡化高血壓愈后，因此血管內皮收縮因子的增多與減少被認為是高血壓病發生、發展過程中的重要因素[1，2]。同時血管內皮的功能異常在高血壓病、動脈粥樣硬化、冠心病及缺血-再灌注損傷、休克等許多心血管疾病的發生、發展過程中具有重要的意義[3～5]。研究表明，人體內維生素D的水平與心力衰竭、心血管疾病的發生率呈反比[6～8]。人們發現在長期接受維生素D的治療后， 慢性腎功能不全患者的心血管事件的發生率以及病死率有明顯降低的趨勢，并且透析前死亡風險也相對降低[9，10]。相關研究發現，血液中的1，25二羥基維生素D的濃度越低，心肌梗死的風險會越高[11]。維生素D3是維生素D族中有著最高生物代謝率的一種活性形式，與動脈血壓呈負相關[12～14]。研究發現，個體產生或者攝入維生素D不足會有更高的高血壓易患因素[15～17]。

雖然維生素D3在降壓方面的研究很多，但涉及血管內皮收縮與舒張的作用及機制的研究尚少。本研究旨在探討維生素D3對高血壓狀態下血管內皮舒張與收縮的影響及環氧化酶(COX)的信號轉導途徑的機制研究，以探討維生素D3的抗血管收縮及抗高血壓保護作用機制。

材料與方法

1.實驗動物及分組:選擇雄性自發性高血壓病大鼠(spontaneously hypertensive rats SHR)(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，38～42周齡，體質量600～800g，實驗開始前測量老鼠血壓≥160/90mmHg(1mmHg=0.133kPa)可以入組。將大鼠分為維生素D3治療組和對照組，每組20只。維生素D3治療組給予維生素D310ng/(100g·d)灌胃，持續3周治療；對照組給予蒸餾水1ml/(kg·d)灌胃，療程3周。所有大鼠給予正常喂食及飲水，每日喂藥前測量體質量。3周的治療結束后，測量血壓，給予自發性高血壓病大鼠苯巴比妥70mg/kg腹膜下麻醉，留取血樣，離取主動脈環用于實驗。

2.試劑與儀器：換能器(美國Assay Designs公司)，放大器(Powerlab model ML785 and ML119)，多導生理記錄儀(美國AD Instruments公司)，Bio-Rad蛋白分析儀(美國Bio-Rad公司)；一氧化氮合成酶抗體及環氧化酶-1抗體(美國R&D公司)，過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG抗體(美國R&D公司)。ELISA試劑盒 (美國Caymen Chemical公司) 測量內皮收縮因子的釋放。

3.實驗方法：(1)對自發性高血壓病大鼠每日測量體質量。直到實驗前記錄并比較兩組實驗動物的體質量變化。(2)經給藥3周后，對比維生素D3治療組及對照組自發性高血壓病大鼠血壓的變化。采用Tail-cuff方法測量鼠尾的血壓。(3)血管張力的測定：離取大鼠的主動脈，阻斷血流，離斷血管后10min內獲得靶血管，保存在4℃克-林二氏重碳酸鹽緩沖液中。觀察靶血管管壁有無肉眼可見病變或是動脈粥樣硬化性改變。取得的血管環用兩根鋼絲牽引，操作在10ml的組織水浴槽(37℃、pH 7.4、95% O2、5% CO2)中進行。拉力傳感器、換能器、放大器及多導生理記錄儀等檢測設備連接鋼絲的一端上，用以記錄等長張力的變化；鋼絲另一端則固定于可以精細調節的裝置上用以調節被動張力。組織水浴槽需要用緩沖液沖洗，間隔15min，直至平衡至少90min。在此期間，讓實驗血管環逐漸達到最佳靜息張力狀態。可給予2.5g血管環靜止的持續性張力，該狀態直至實驗結束，即所有實驗均在此狀態/實驗平臺上完成。部分實驗中通過浸泡血管環于triton溶液中(0.1%)30s，從而去除血管內皮，用于對照實驗。(4)一氧化氮(NO)測定：給藥3周后，維生素D3治療組及對照組自發性高血壓病大鼠給予戊巴比妥100mg/kg皮下注射麻醉后，留取血液樣本。購買ELISA試劑盒，測量NO含量。(5)一氧化氮合成酶、環氧化酶-1(COX-1)蛋白表達：將血管組織冷凍于提取緩沖液(1∶3wt/vol)，主要成分為140mmol/L NaCl，10mmol/L Tris HCl, pH 7.5，1mmol/L EDTA,25%甘油, 0.5% SDS, 0.5% 已基苯基聚乙二醇(Nonident P-40), 0.1mmol/L PMSF, 100ng/ml 蛋白酶混合抑制劑；然后行均質化處理(30s、2000r/min)。離心(4℃、10min、14000r/min), 采用Western blot法來測量上清液蛋白濃度，采用Bio-Rad蛋白分析儀，-80℃液氮冷凍保存。在十二烷基磺酸鈉中加入血管胞質蛋白40μg,95～100℃ 5min。然后行10%十二烷基磷酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后轉膜,置于5%脫脂奶粉溶于TBST中2h。將山羊抗人一氧化氮合成酶及環氧化酶-1抗體以1∶400比例稀釋于TBST(含5%牛血清白蛋白)中，4℃過夜。然后加入辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG抗體1∶2000稀釋于TBST(含5%脫脂奶粉)中,室溫孵育1.5～2.0h，再次洗膜。然后與1∶20稀釋的LumiGLOTM發光劑及過氧化物反應1min,自顯影。(6)血管內皮收縮因子測定：離體血管環經過收縮實驗后前列腺素釋放內皮依賴性收縮因子，主要包括(PG)F1α(PGF1α)、PGF2α和血栓素A2，收集浴槽內液體通過ELISA法進行分析。

結 果

1.體質量及血壓改變：經過維生素D3長期應用，治療組體質量保持上升，對照組大鼠體質量在20天時開始呈下降趨勢(圖1A)，治療組血壓較對照組血壓明顯下降(圖1B)。

圖1 維生素D3對體質量及血壓的影響A.體質量；B.血壓;與對照組比較,*P<0.05

2.離體主動脈血管張力測定結果：給予維生素D3治療3周后，比較主動脈環(有血管內皮)的藥物濃度舒張曲線。維生素D3治療組血管環的藥物濃度舒張曲線較對照組降增加達43.0%±2.3%。隨之繼發性血管收縮(圖2A)。給予維生素D3治療3周后，比較主動脈環(無血管內皮)對硝普鈉的藥物濃度舒張曲線。維生素D3治療組血管環的藥物濃度舒張曲線較對照組無改變(圖2B)。給予維生素D3治療3周后，比較主動脈環的藥物濃度收縮曲線。維生素D3治療組主動脈環的藥物濃度收縮曲線較對照組降低血管收縮達24.0%±1.5%。無血管內皮組，無明顯血管收縮(圖2C)。

圖2 維生素D3對血管張力的影響A.血管舒張；B.血管舒張；C.血管收縮；與其他3組比較，*P=0.001；與對照組(有血管內皮)比較，#P=0.007;與對照組(無血管內皮)比較，ΔP=0.021

3.NO含量測定：經過維生素D3長期給藥，維生素D3治療組一氧化氮釋放較對照組明顯上升，詳見圖3。

4.血管內皮一氧化氮合成酶的蛋白表達：在自發性高血壓病大鼠經過3周維生素D3給藥后，在有血管內皮存在的基礎上，一氧化氮合成酶表達明顯增加，詳見圖4。

5.血管內皮環氧化酶-1蛋白表達：在自發性高血壓病大鼠中，給予維生素D3藥物治療3周后，在有血管內皮存在的基礎上，環氧化酶-1表達明顯減少，無血管內皮的存在，環氧化酶-1的表達無區別，詳見圖5。

圖3 一氧化氮的表達與對照組比較，*P=0.001

6.血管內皮收縮因子的釋放：血管內皮收縮因子的釋放主要依賴測定其代謝產物的表達。與對照組比較，維生素D3可以明顯減少6-keto prostaglandin F1α(PGF1α, 前列環素的穩定代謝產物)、PGF2α和thromboxane B2(血栓素A2的穩定代謝產物)的釋放，與對照組釋放相似，詳見圖6。

討 論

血管內皮可以通過釋放血管活性物質控制內皮下平滑肌細胞發揮調節血管緊張性的作用[18]。本研究應用乙酰膽堿激發的血管舒張實驗結果顯示，在有血管內皮的情況下，長期維生素D3治療可以增加內皮依賴的血管舒張作用；在沒有血管內皮的情況下，血管不產生舒張，治療組和對照組之間比較差異無統計學意義。同樣，在應用A23187激發的血管收縮實驗中，也獲得了與乙酰膽堿舒張實驗結果相似的趨勢，即有血管內皮存在可增加收縮作用，無血管內皮則無效果。應用硝普鈉進行管舒張實驗顯示，維生素D3治療組與對照組比較，血管舒張程度一致，既不受有無血管內皮的影響，也不受藥物治療影響。這些現象證明了長期維生素D3治療影響血管的收縮與舒張沒有改變自發高血壓大鼠的主動脈血管平滑肌的生物活性，只對血管內皮起到有效的作用。與此同時，血管內皮依賴的血管張力實驗證明，血管舒張在長期治療給藥后可以得到明顯修復；血管的收縮明顯降低，證明了血管舒張與血管內皮收縮存在一種平衡機制，相互協調與制約。這也說明在疾病的發生、發展過程中血管內皮的活性變化是制約血管收縮與舒張的先決條件。本實驗結果中一氧化氮及收縮因子的測定更進一步證明了該結論。

圖4 一氧化氮合成酶的蛋白表達與對照組比較，*P=0.021

圖5 環氧化酶-1蛋白表達

圖6 血管內皮收縮因子的測定A.6-酮前列腺素 F1α(PGF1α)；B.前列腺素F2α(PGF2α)；C.血栓素 B2；與對照組比較，*P=0.017,#P=0.013,ΔP=0.012

在眾多血管內皮釋放因子中，由一氧化氮合成酶合成的一氧化氮在內皮依賴性血管舒張因子中起到最為重要的作用[19～21]。血管內皮的損傷通常發生在一氧化氮合成酶表達降低，一氧化氮合成減少，如高血壓[22]。維生素D3對血管內皮有良好的保護作用，同時可以增加一氧化氮合成酶的活性作用[23]。除了釋放一氧化氮之外，血管內皮可以在一氧化氮合成減少的情況下，釋放血管收縮活性物質，如前列腺素類，從而導致血管收縮更加嚴重[24]。本研究旨在證明在動物實驗中長期應用維生素D3是否可以影響血管內皮的收縮。血管內皮收縮因子的產生是通過環氧化酶(COX)介導的。環氧化酶-1被證實是介導血管內皮收縮因子產生的關鍵酶[25]。本研究中，自發高血壓大鼠經過3周維生素D3治療后，環氧化酶-1的表達明顯降低，環氧化酶-2無改變(該組數據未呈現)。因此環氧化酶-1被證實是在自發高血壓大鼠中介導血管內皮收縮因子產生的關鍵酶。當考慮到血管內皮收縮時，很多實驗主要考慮到的影響血管內皮收縮因子合成的酶即為環氧化酶-1。有研究證明，在自發高血壓大鼠中，環氧化酶-1的表達是增高的。維生素D3長時間干預后，自發性高血壓病大鼠胸主動脈血管環的收縮較對照組明顯減低，收縮狀態得到明顯改善，結果提示維生素D3是血管內皮損傷的保護性修復因素。綜上所述，環氧化酶-1蛋白的表達在維生素D3長期給藥后明顯減少，證明維生素D3可以改變環氧化酶-1的表達在有疾患的血管，并且可以減少環氧化酶-1的過度表達。

維生素D3是維生素D主要活化形式，其血清濃度與動脈血壓的數值呈反比關系[12]。在大鼠中維生素D的缺乏已被證實與心肌纖維化和心肌肥厚明顯相關。日前可以系統逆轉心血管內皮細胞損傷的方法并不多見，而維生素D3可以做到。這是一種修復心血管系統的非常廉價的措施。維生素D3可通過刺激一氧化氮產生，降低血管內皮細胞的氧化應激程度，從而改善血流，起到保護血管的作用。曬太陽會使身體自然產生維生素D3，但僅通過這一途徑難以獲取足夠的維生素D3，并且在陽光中過多暴曬會增高皮膚癌等患病風險。而口服補充外源性的維生素D3就更容易實現。

綜上所述，長期持續給予維生素D3治療可以減少自發高血壓大鼠主動脈的血管內皮收縮，這種抑制效應伴隨著血壓的下降、一氧化氮合成酶的升高及環氧化酶-1的合成減少。受研究條件和動物數量所限，本研究仍然存在一定局限性，如只研究了一個劑量的維生素D3治療組，未能進行不同治療劑量之間效果差異的對比；未能進行不同給藥時間情況下各項指標的動態監測。后續研究筆者將增加劑量和時間點的設置，并采用蛋白組學或轉錄組學等高通量檢測手段，在基因調控和蛋白表達的水平上對該機制進行進一步闡明。