子宮頸癌ADAM12檢測及臨床預后分析

白 璐 李雯慧 陳必良

子宮頸癌(cervical cancer)在全球婦科惡性腫瘤發生率中位居第3位，據統計全球每年新增病例50萬例，每年病死患者26萬例[1]。子宮頸癌在發展中國家發生率更高，是女性腫瘤性疾病死亡的主要婦科疾病。病毒感染、基因突變及環境因素是導致子宮頸癌發生、發展的重要因素[2～5]。從宮頸上皮內瘤樣病變發展為子宮頸病灶，進而形成子宮頸腫瘤，該過程主要是由人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染引發的[6,7]。目前，大量研究報道了與宮頸癌密切相關的原癌基因和抑癌基因，然而調節子宮頸癌病理變化的具體機制仍有待研究，且目前臨床上缺乏一種準確、高效預測子宮頸癌患者臨床預后的標志物[8～11]。

ADAM金屬蛋白酶結構域12基因(ADAM metallopeptidase domain 12, ADAM12)編碼了ADAM12蛋白，該蛋白是去整合素和金屬蛋白酶家族成員[12]。由于mRNA的不同拼接導致人機體中存在兩類ADAM12(又稱解鏈蛋白酶α)，分別為長跨膜型(ADAM12-L)和截斷分泌型(ADAM12-S)，與前者比較后者缺失了跨膜區和胞內區。ADAM12-L和ADAM12-S經過酶解作用，成熟的蛋白會分別轉移到細胞膜和胞外[13]。

ADAM12作為預后標志物是因為其主要在病理情況下才激活表達，而在正常組織中通常是嚴格的表達限制狀態[14]。除了在人的胎盤組織及在胚胎發育成肌肉和骨組織過程中瞬時表達升高外，在后天生長的健康機體和非損失器官中ADAM12表達均處于較低狀態[15]。研究表明，ADAM12在人類多種腫瘤組織中表達增加，例如胃癌、前列腺癌、肺癌、腦癌、骨癌、肝癌及乳腺癌等[16～22]。然而，ADAM12在子宮頸癌中的表達情況尚未見詳細報道，本研究通過檢測和比較子宮頸癌患者腫瘤組織及癌旁組織中ADAM12表達，驗證ADAM12能否作為該疾病的預后標志物。

材料與方法

1.患者及樣品:本研究中使用的子宮頸癌組織、癌旁組織及尿液樣品(距離腫瘤組織≥3cm)樣品(各78例)均采集2008年1月～2012年1月筆者醫院婦科診治的子宮頸癌患者，所有患者均采用病理學方法進行確診，收集同期80例在筆者醫院健康體檢的正常人群尿液樣品作為對照。采用國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)標準對子宮頸癌患者進行臨床分期，詳見表1。患者隨訪時間為2～71個月，隨訪截至時間2018年2月。本研究獲得入組患者知情同意并通過筆者醫院醫學倫理學委員會審核。

2.RNA提取及定量PCR分析:采用GenEluteTM總RNA提取試劑盒(美國Sigma公司)提取組織總RNA，QuantiTect反轉錄試劑盒(美國Qiagen公司)合成cDNA。ADAM12定量PCR引物序列如下：上游引物: 5′- CGAGGGGTGAGCTTATGGAAC-3′；下游引物: 5′- GCTTTCCCGTTGTAGTCGAAT A-3′。將引物與SYBR Green預混Mix(美國Bio-Rad公司)混合，加入模板后進行擴增。選擇β-actin基因作為內參，引物序列如下：上游引物: 5′-TGACGTGGACAT-CCGCAAAG -3′；下游引物: 5′-CTGGAAGGTGGACATCCGCAAAG -3′，在Thermo的7500型定量PCR儀進行擴增，結果采用2-ΔCT方法進行比較，每個樣品重復3個復孔。

表1 ADAM12表達與子宮頸癌患者臨床病理學特征關系分析[n(%)]

3.酶聯免疫吸附測定尿液ADAM12含量:參照人ADAM12 ELISA定量檢測試劑盒(美國R&D公司)操作步驟檢測尿液樣品中ADAM12含量，簡要如下：向包被人特異性ADAM12單克隆抗體的酶標板中100μl ADAM12標準品及待檢尿液，室溫孵育2h，每孔加入300μl PBST，反復洗滌3次，最后1次拍板清除殘留洗滌液，加入200μl 稀釋好的HRP標記的ADAM12特異性抗體，再次室溫孵育40min，每孔加入300μl PBST，反復洗滌3次，加入100μl底物，避光反應15min，最后加入50μl 2mol/L H2SO4終止反應。采用酶標儀(美國Bio-Rad公司)測定吸光度值A450，根據標準品標定的標準曲線計算待檢樣品的ADAM12含量。根據健康人群尿液ADAM12含量(平均值+3倍SD值)作為尿液ADAM12是過表達的臨界值。

4.Western blot法檢測子宮頸癌組織及癌旁組織ADAM12表達：采用組織總蛋白提取試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)提取子宮頸癌組織和癌旁組織總蛋白，參考文獻[23]報道的方法進行Western blot法檢測。制備10% SDS-PAGE凝膠后，將收集的樣品上樣，跑膠后轉膜，將膜放入10%脫脂奶中37℃封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜。次日，采用TBST溶液洗滌4次，每次10min，然后將膜放入含HRP標記二抗的TBST溶液中，室溫孵育1h。之后加入發光液進行曝光。Western blot法檢測用的抗體為ADAM12單克隆抗體(美國Sigma-Aldrich公司)，采用β-actin蛋白作為內參，β-actin一抗購自美國Sigma公司。

5.免疫組織化學檢測子宮頸癌組織及癌旁組織ADAM12表達:制備組織石蠟切片，首先進行抗原修復，采用0.01mol/L pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液對切片進行。隨后將切片放入稀釋后的鼠抗人ADAM12單克隆抗體(美國Sigma公司)中4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育40min，再次洗滌3次后加入DAB溶液進行顯色后，白光拍照。參考文獻[23]報道方法根據染色強度進行切片打分，切片評分是由兩位對患者臨床病理特征不了解的病理學專家獨立完成。具體標準如下：0分(陰性)，1分(弱陽性)，2分(中等)，3分(強陽性)。將陽性細胞比例分成5個區間，0分(0%)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。切片的最終得分是上述兩個分數相乘，總分在0～12分。為了評價ADAM12與子宮頸癌患者臨床病理學特征之間的相關性將ADAM12表達分成兩類：低表達(得分0～4分)，高表達(得分5～12分)。

結 果

1.ADAM12在子宮頸癌患者腫瘤組織中表達增加:采用定量PCR法檢測78例子宮頸癌患者腫瘤組織及癌旁組織中ADAM12 mRNA表達水平，結果表明，78例子宮頸癌組織中ADAM12相對表達水平為3.46±0.64，顯著高于癌旁組織(0.64±0.17,P=0.025，圖1A)。Western blot法檢測結果顯示，子宮頸癌組織中ADAM12表達顯著高于癌旁組織(圖1B)。

圖1 78對子宮頸癌組織及癌旁組織ADAM12表達水平檢測結果A.定量PCR法檢測ADAM12 mRNA表達水平；B. Western blot法檢測ADAM12蛋白表達水平

采用免疫組織化學染色檢測了78對子宮頸癌組織及癌旁組織樣品中ADAM12蛋白表達水平，在腫瘤組織和癌旁組織中均觀察到不同強度的蛋白表達(圖2)，然而與癌旁組織比較，子宮頸癌組織中ADAM12蛋白表達量更高。根據評分標準，78例宮頸癌樣品中55例(70.51%)為ADAM12高表達，而在癌旁組織中21例(26.92%)為ADAM12高表達(表2)。

圖2 子宮頸癌及癌旁組織免疫組織化學染色A.子宮頸癌組織(強陽性)；B. 子宮頸癌組織(中等)；C.子宮頸癌組織(弱陽性)；D.癌旁組織(弱陽性)；標尺：100μm

表2 78對子宮頸癌及癌旁組織中ADAM12表達水平比較

2.ADAM12在子宮頸癌患者尿液中表達增加：采用ELISA方法檢測78例子宮頸癌患者尿液及80例健康人群尿液中分泌型ADAM12表達水平，結果表明子宮頸癌組ADAM12平均表達量為2.15±0.68ng/ml，健康人群尿液中ADAM12含量為0.84±0.35ng/ml，兩組比較，差異有統計學意義(P=0.033，圖3)。子宮頸癌組尿液ADAM12含量超平均水平(陽性)樣品27例(34.63%)，陰性樣品51例(65.38%)。

圖3 子宮頸癌患者及健康人群尿液分泌型ADAM12含量

3.子宮頸癌組織ADAM12表達與患者臨床特征分析:ADAM12表達與子宮頸癌患者臨床病理學特征分析結果提示ADAM12表達升高與患者腫瘤侵襲(P=0.014)、TNM分期(P=0.010)、淋巴結轉移(P=0.070)以及腫瘤分化(P=0.034)等因素密切相關(表1)。

4.子宮頸組織ADAM12表達與患者預后分析：生存分析結果表明，ADAM12高表達患者臨床預后不良，ADAM12高表達患者臨床中位生存期為29.5個月，低表達患者臨床中位生存期為49.4個月，差異有統計學意義(P=0.003，圖4)。單因素分析結果表明，腫瘤侵襲(HR=3.633, 95% CI: 1.715～8.526,P=0.017)、淋巴結轉移(HR=4.731, 95% CI: 2.636～10.427,P=0.006)、TNM分期(HR=3.041, 95% CI: 1.557～7.062,P=0.027)、組織ADAM12表達(HR=6.466, 95% CI: 3.452～13.690,P=0.004)是影響子宮頸癌患者疾病預后的危險因素(表3)。多因素分析結果表明，子宮頸癌患者淋巴結轉移(HR=3.646, 95% CI: 1.683～5.482,P=0.016)及組織ADAM12表達(HR=4.245, 95% CI: 2.614～6.735,P=0.007)是患者預后不良標志物(表3)，而患者年齡、腫瘤直徑、HPV感染、腫瘤組織學類型、腫瘤侵襲、腫瘤分化、TNM分期不是影響患者疾病預后的危險因素。

圖4 ADAM12表達與子宮頸癌患者總生存期預后的Kaplan-Meier分析

表3 子宮頸癌患者總生存期單一和多重變量分析

討 論

ADAMs家族蛋白具有十分特別的胞外區結構域，例如前導肽序列、金屬蛋白酶結構域、表皮生長因子樣重復結構域、解聚素結構域、富含半胱氨酸結構域等[24,25]。ADAMs家族蛋白的不同結構域發揮不同的生物學功能參與機體多種生物學途徑，其中ADAMs的蛋白酶活性及細胞因子和趨化因子的膜錨定分子的功能在腫瘤的發生過程中發揮重要作用。大量文獻研究證實，ADAM12表達水平升高與多種腫瘤的發生密切相關。與正常小鼠比較，乳腺癌及前列腺癌小鼠模型ADAM12-/-小鼠的腫瘤生長和遷移均顯著降低[17, 23]。提示ADAM12是腫瘤發生中必須的。臨床研究證實，ADAM12可以作為腫瘤診斷和預后的標志物[25]。例如，Western blot法檢測分析結果顯示，與健康人群比較,乳腺癌患者ADAM12腫瘤組織中表達顯著升高。除檢測乳腺癌組織中表達外，患者尿液中ADAM12水平與腫瘤分期及疾病進展密切相關。

本研究顯示，子宮頸癌患者腫瘤組織中ADAM12表達水平均顯著高于癌旁組織，子宮頸癌患者尿液中ADAM12表達水平顯著高于健康人群。Kaplan-Meier生存分析結果表明ADAM12高表達患者臨床預后不良，ADAM12高表達患者臨床中位生存期顯著低于低表達患者(P=0.003)。單因素分析結果表明，腫瘤侵襲(HR=3.633, 95% CI: 1.715～8.526,P=0.017)、淋巴結轉移(HR=4.731, 95% CI: 2.636～10.427,P=0.006)、TNM分期(HR=3.041, 95% CI: 1.557～7.062,P=0.027)、組織ADAM12表達(HR=6.466, 95% CI: 3.452～13.690,P=0.004)是影響子宮頸癌患者疾病預后的危險因素。多因素分析結果表明，子宮頸癌患者淋巴結轉移(HR=3.646, 95% CI: 1.683～5.482,P=0.016)及組織ADAM12表達(HR=4.245, 95% CI: 2.614～6.735,P=0.007)是患者預后不良標志物。此外，本研究顯示，子宮頸癌患者尿液中ADAM12含量顯著高于健康人群，然而統計單因素分析結果表明，尿液ADAM12水平不是子宮頸癌患者總生存期預后的獨立因素。

綜上所述，本研究結果證實ADAM12參與子宮頸癌的發生和發展，其在子宮頸癌組織中表達普遍上調。ADAM12表達是宮頸癌患者總生存期預后不良的重要因素，組織ADAM12表達可以作為子宮頸癌患者疾病預后獨立標志物。