貽貝黏蛋白體外抗單純皰疹病毒-2型的作用

宋莎莎 李新宇 王永芳

海洋生物的多樣性以及活性功能的獨(dú)特性在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用已受到人們的重視[1]。貽貝黏蛋白(mussel adhesive protein, MAP)為海洋紫貽貝的足絲腺中生成和儲(chǔ)存的一種天然蛋白質(zhì)，經(jīng)提取純化后成為一種多酚類單一蛋白生物材料[2]。MAP分子結(jié)構(gòu)中因含有20%的賴氨酸，使該蛋白具有較高的等電點(diǎn)，在人體生理pH值條件顯示很強(qiáng)的正電荷性能。而人體的各類細(xì)胞往往帶有負(fù)電荷，因此MAP可通過(guò)靜電相互作用與細(xì)胞結(jié)合，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出極具潛力的應(yīng)用價(jià)值，如用于生物醫(yī)用粘接、形成保護(hù)膜以及體外組織培養(yǎng)時(shí)促進(jìn)細(xì)胞貼壁爬行等[3～5]。MAP在促進(jìn)創(chuàng)面愈合、止癢和抑菌方面的作用也有報(bào)道[6～9]。MAP具有的保護(hù)膜特性對(duì)于保護(hù)組織免于病原體侵害亦具有重要意義。

人單純皰疹病毒(HSV)是侵犯人類的常見(jiàn)病原體，屬于皰疹病毒科α病毒亞科，分為 HSV-1和HSV-2兩個(gè)血清型，前者常引起唇皰疹，后者是生殖器皰疹的主要病原體[10]。生殖器皰疹是我國(guó)發(fā)生率較高的性傳播疾病之一，該病容易復(fù)發(fā)，可導(dǎo)致胎兒發(fā)育畸形。目前臨床上常用的抗HSV藥物仍然以嘌呤核苷類似物為主，如阿昔洛韋類、噴昔洛韋等，但隨著耐阿昔洛韋HSV株的出現(xiàn)，尋找具有對(duì)抗HSV活性的新物質(zhì)極其重要。本研究利用HSV-2體外感染非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)模型，觀察MAP對(duì)HSV-2感染是否具有保護(hù)性。

材料與方法

1.主要儀器與試劑：ECLIPSE TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific股份有限公司)；超低溫冰箱(青島海爾公司，DW-86L486)； RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT，美國(guó)Sigma公司)。

2.試驗(yàn)藥材：貽貝黏蛋白凍干粉(MAP，江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司，純度87.04%，用氯化鈉注射液溶解成20μg/μl原液，臨用前用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液或含2%血清的RPMI 1640維持液配制)；十二烷基磺酸鈉(SDS，美國(guó)Amresco公司，純度99%，臨用前用培養(yǎng)液或維持液配制)；阿昔洛韋(ACV，江蘇知原藥業(yè)有限公司，純度99.3%，臨用前用培養(yǎng)液或維持液配制)。

3.細(xì)胞株和病毒株：非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞，上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù))；HSV-2質(zhì)控株(sav，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

4.HSV-2病毒擴(kuò)增：將HSV-2病毒液接種至單層生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞中，吸附1h后去除，補(bǔ)充維持液于37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)，鏡下觀察直至95%以上細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，即細(xì)胞腫脹或變圓。將吸附病毒后的細(xì)胞反復(fù)凍融，3000r/min離心10min去除細(xì)胞沉淀物，上清少量分裝，低溫保存。

5.病毒毒力測(cè)定：對(duì)數(shù)期Vero細(xì)胞收集并計(jì)數(shù)后，以2×104/孔密度接種于96孔板，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)過(guò)夜，鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)成單層。取上述收集的病毒液，用維持液依次10倍稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77個(gè)稀釋度，分別接種至單層Vero細(xì)胞中，0.1毫升/孔。吸附1h后去除上清，用維持液沖洗細(xì)胞2次，補(bǔ)充維持液繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，24h后顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。病毒半數(shù)感染劑量(TCID50)計(jì)算：按Reed和Muench常規(guī)法計(jì)算，即TCID50= >50%病變率稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)；距離比例=(>50%病變百分?jǐn)?shù)-50%)/(>50%病變百分?jǐn)?shù)-<50%病變百分?jǐn)?shù))。

6.受試物對(duì)細(xì)胞毒性測(cè)定：采用形態(tài)觀察法結(jié)合MTT法進(jìn)行，MAP和對(duì)照藥ACV以及SDS均用培養(yǎng)液稀釋成4個(gè)濃度，即MAP為500.0、250.0、125.0、62.5μg/ml；ACV為100.0、50.0、25.0、12.5μg/ml；SDS為250.00、125.00、62.50、31.25μg/ml。將已稀釋好的藥液加入到長(zhǎng)成單層Vero細(xì)胞的培養(yǎng)板中，0.2毫升/孔，每個(gè)濃度重復(fù)3孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照孔。培養(yǎng)24h后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化，計(jì)數(shù)3個(gè)視野中形態(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞百分率。計(jì)算半數(shù)中毒濃度(TC50)和最大無(wú)毒濃度(TC0)。觀察完畢后加5mg/ml的MTT 20微升/孔，孵育4h，棄各孔上清液，每孔加DMSO 150μl，室溫暗處震蕩10min，在MULTISKAN APECTRUM酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定550nm處吸光度值(A550nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)。

7.MAP對(duì)HSV-2的直接影響作用：采用類似于中和實(shí)驗(yàn)中的方法，改良后進(jìn)行，并以SDS作為陽(yáng)性測(cè)試對(duì)照同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)病毒毒力測(cè)定結(jié)果，取200TCID50病毒液與等體積不同濃度的MAP(125.0000～7.8125μg/ml)或SDS(62.5000～3.9063μg/ml)混合，此時(shí)病毒液的終濃度為100TCID50，然后置37℃水浴孵育1h。將孵育后的病毒液接種至長(zhǎng)成單層Vero細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中0.1毫升/孔。吸附1h后棄去，維持液沖洗2次，加入維持液0.2毫升/孔繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)受試濃度重復(fù)3孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)溶媒對(duì)照、病毒對(duì)照以及正常細(xì)胞對(duì)照組。24h后顯微鏡下觀察細(xì)胞病變率，并計(jì)算抑制作用的半數(shù)有效濃度(EC50)。

8.MAP對(duì)HSV-2感染Vero細(xì)胞后效應(yīng)的抑制作用：以ACV作為陽(yáng)性對(duì)照藥同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取100TCID50病毒液接種于長(zhǎng)成單層Vero細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml。吸附1h后棄去，維持液沖洗2次，加入不同濃度MAP(125.0000～7.8125μg/ml)或ACV(100.00～6.25μg/ml)藥液0.2毫升/孔，置于37℃、5%CO2中繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)受試濃度重復(fù)3孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)溶媒對(duì)照、病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照組。24h后顯微鏡下觀察細(xì)胞病變率，計(jì)算抑制作用的半數(shù)有效濃度(EC50)。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩個(gè)獨(dú)立樣本組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.病毒毒力測(cè)定：鏡下觀察正常Vero細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞膜界限清晰，胞質(zhì)透明度好，細(xì)胞形態(tài)完整，HSV-2感染所致的細(xì)胞病變表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓甚至漂起，用Reed-Muench計(jì)算病毒的TCID50為10-4.55(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下不同稀釋度的HSV-2致Vero細(xì)胞病變觀察(×100)

2.MAP對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響和毒性：受試物處理24h后首先觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，根據(jù)形態(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞百分率計(jì)算的毒性結(jié)果見(jiàn)表1。用MTT法進(jìn)一步測(cè)定后顯示，MAP在500.0～62.5μg/ml受試濃度范圍內(nèi)Vero細(xì)胞的存活率在90%以上。對(duì)照藥ACV在12.5～100.0μg/ml濃度內(nèi)細(xì)胞存活率亦在90%以上。SDS在62.50～31.25μg/ml濃度Vero細(xì)胞存活率在70%以上，結(jié)果見(jiàn)圖2。

表1 MAP和對(duì)照藥作用于Vero細(xì)胞24h后根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變計(jì)算毒性結(jié)果

3.MAP對(duì)HSV-2的直接影響作用：用不同濃度的MAP預(yù)先處理HSV-2后再感染Vero細(xì)胞，處理后的病毒所導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)受到不同程度的抑制，且隨著MAP濃度增大，抑制作用越明顯，與溶媒對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其EC50為54.88μg/ml。陽(yáng)性對(duì)照測(cè)試物SDS對(duì)HSV-2亦表現(xiàn)出明顯的直接影響作用，受其處理后的病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)受到明顯抑制，EC50為22.10μg/ml，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖2 MAP和對(duì)照藥對(duì)Vero細(xì)胞的MTT測(cè)定結(jié)果A.MAP;B.ACV;C.SDS

圖3 HSV-2經(jīng)MAP和SDS預(yù)先處理后對(duì)Vero細(xì)胞引起的病變率A.MAP;B.SDS;與溶媒對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

4.MAP對(duì)HSV-2感染Vero細(xì)胞后病變效應(yīng)的抑制作用：用HSV-2攻擊Vero細(xì)胞后再加入MAP處理，觀察到其對(duì)病毒導(dǎo)致的細(xì)胞腫脹效應(yīng)有一定的抑制作用，與溶媒對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，抑制作用的EC50值>125μg/ml。對(duì)照藥ACV亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，EC50值為6.38μg/ml，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖4 HSV-2經(jīng)MAP和SDS預(yù)先處理后導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)(×100)

圖5 MAP和ACV對(duì)HSV-2感染Vero細(xì)胞后病變效應(yīng)的抑制作用A.MAP;B.ACV;與溶媒對(duì)照組比較，**P<0.01

圖6 MAP和ACV對(duì)HSV-2感染Vero細(xì)胞后病變效應(yīng)的抑制作用(×100)

討 論

HSV-2是一種重要的生殖器皰疹病原體，全球HSV-2感染率較高，是性接觸的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。與HSV-1比較，HSV-2感染人體后能產(chǎn)生更高的病毒載量，并能通過(guò)其周圍的神經(jīng)軸突到達(dá)骶神經(jīng)節(jié)并在此潛伏，因此潛伏感染、周期性復(fù)發(fā)是此病毒的致病特性，其并發(fā)癥以生殖器潰瘍最常見(jiàn)，在免疫力低下的患者甚至引起更嚴(yán)重的感覺(jué)神經(jīng)和自主神經(jīng)的急性炎癥[11，12]。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制是復(fù)雜但又程序化的過(guò)程，即吸附、穿入、脫衣殼、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、核衣殼組裝和病毒的釋放等多個(gè)環(huán)節(jié)，影響上述復(fù)制循環(huán)中任一環(huán)節(jié)均可能起到抗病毒感染作用。目前使用的抗病毒藥物如阿昔洛韋、阿糖腺苷等，能抑制病毒DNA的復(fù)制，但不能徹底防止?jié)摲腥镜膹?fù)發(fā)，且抗病毒譜窄，較易產(chǎn)生耐藥性，是發(fā)展抗病毒藥關(guān)注的問(wèn)題[13]。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和組織工程學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的生物材料被用于醫(yī)療領(lǐng)域。我國(guó)海洋資源物產(chǎn)豐富，海洋生物活性物質(zhì)的利用已成為當(dāng)今海洋生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)。MAP是從海洋紫貽貝的足絲腺中提純的一種天然蛋白質(zhì)，利用其高載量的正電荷能與細(xì)胞、病原體或病原體感染后的細(xì)胞相結(jié)合的特性，在保護(hù)皮膚免于感染方面具有一定優(yōu)勢(shì)[14]。

體外抗病毒活性研究通常采用細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)作為觀察指標(biāo)，評(píng)估受試物的抗病毒活性。本研究中筆者首先將MTT測(cè)定與形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合，測(cè)試受試物自身對(duì)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)活力是否有影響。MTT結(jié)果表明，MAP在500.0～62.5μg/ml范圍對(duì)細(xì)胞活力并無(wú)明顯影響，但在鏡下可觀察到MAP>125μg/ml濃度時(shí)，50%的細(xì)胞表現(xiàn)出折光性改變、邊界模糊，提示此濃度下細(xì)胞雖未死亡，但生長(zhǎng)仍然受影響。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在后續(xù)的抗病毒試驗(yàn)時(shí)筆者以125μg/ml作為起始濃度。SDS是測(cè)試MAP對(duì)HSV-2直接影響時(shí)選擇的陽(yáng)性對(duì)照物。SDS是一種陰離子表面活性劑，廣泛用于洗滌、消毒、日用品等方面，有研究表明SDS亦具有高效的抗HSV-2效應(yīng)，并且它在1.25mg/ml濃度時(shí)不表現(xiàn)出對(duì)Vero細(xì)胞的毒性[15]。但本研究用觀察法測(cè)得它對(duì)Vero細(xì)胞的無(wú)毒濃度≤62.5μg/ml，用MTT法進(jìn)一步測(cè)得SDS在62.50～31.25μg/ml 濃度范圍可保持Vero細(xì)胞的存活率在70%以上，而將濃度升高到125和250μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率低于10%，并且該結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)中數(shù)次被證實(shí)。結(jié)合SDS在其他細(xì)胞的活性研究報(bào)道，在≥200μg/ml濃度時(shí)可使人牙周膜細(xì)胞全部死亡，在≤25μg/ml時(shí)則對(duì)該細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響[16]。筆者分析，所得到的細(xì)胞對(duì)SDS耐受濃度不一致結(jié)果可能與所用的SDS來(lái)源有關(guān)，筆者的實(shí)驗(yàn)以及牙周膜細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均使用的是純度≥99%的美國(guó)Amresco公司和美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，可能對(duì)細(xì)胞的作用更加敏感。

中和試驗(yàn)是用于測(cè)試病毒感染力的經(jīng)典方法，包括固定病毒-稀釋血清法和固定血清-稀釋病毒法[17]。本研究采用的是中和試驗(yàn)方式并稍加改良，選擇固定病毒-稀釋血清(受試物)的測(cè)定方式來(lái)評(píng)估MAP對(duì)HSV-2的直接影響。用MAP與HSV-2作預(yù)混后，再將處理后的病毒去攻擊Vero細(xì)胞，結(jié)果表明MAP對(duì)HSV-2產(chǎn)生直接影響，處理后的病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)受到抑制(EC50為54.88μg/ml)，提示MAP可降低甚至消除HSV-2對(duì)宿主細(xì)胞造成的攻擊，使宿主細(xì)胞免于感染。推測(cè)MAP的這種作用可能與其分子特性有關(guān)，即通過(guò)封閉病毒包膜而影響其與宿主細(xì)胞的吸附，從而發(fā)揮抗病毒感染效應(yīng)。當(dāng)HSV-2感染Vero細(xì)胞后再給予MAP時(shí)，對(duì)病毒所致的細(xì)胞病變效應(yīng)亦有一定的抑制作用，但所需的EC50在125μg/ml以上，提示增加MAP的濃度可能達(dá)到抑制HSV-2攻擊宿主細(xì)胞后引起的病變效應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明MAP在對(duì)抗HSV-2感染方面具有抑制作用，提示其在抗HSV活性進(jìn)而保護(hù)宿主免于感染方面具有一定的潛力。有關(guān)MAP是否能干擾病毒的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或蛋白合成還有待于進(jìn)一步研究。