利拉魯肽對非酒精性脂肪肝大鼠ERp46蛋白和脂聯素及氧化應激的影響

王愛芳，鐘 興，潘天榮

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前常見的肝臟慢性疾病，如今在飲食、環境等因素的影響下，其發病年齡呈年輕化趨勢，可發展成為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等疾病。ERp46為內質網蛋白之一，ERp46 mRNA和蛋白在肝組織中高度表達，與蛋白質二硫鍵異構酶 (protein disulphide isomerase,PDI)有關，在細胞內可能起到分子伴侶的作用，可促進蛋白折疊和二硫鍵形成[1]。目前推測它可能具有多種生物學功能。胰高血糖素樣肽1 (glucagon-likepeptide 1，GLP-1) 類似物利拉魯肽 (liraglutide) 具有抗炎及改善糖脂質代謝紊亂等作用[2]。近年來，各種研究不斷拓展它除降糖減重以外的臨床應用范圍?，F利用高脂飲食誘導的NAFLD大鼠，觀察利拉魯肽對NAFLD大鼠肝組織ERp46表達的影響，旨在初步探討利拉魯肽改善NAFLD 的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠共32只，體質量(180±10)g，每標準鼠籠4～5只，室內溫度20～25 ℃，明暗各12 h，購自安徽省實驗動物中心。

1.2 實驗材料利拉魯肽：諾和諾德公司(批號：DP51077)；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、丙二醛 (malonaldehyde,MDA)、游離脂肪酸 (free fatty acids, FFA)檢測試劑盒(南京建成生物技術有限公司)；脂聯素 (adiponectin, ADP)和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor, TNF-α)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗ERp46(美國 Santa Cruz Biotechnology 公司)；兔抗GAPDH、羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1模型建立及處理 32只大鼠隨機分成高脂組20只及正常對照組12只，分別予高脂飼料及普通飼料喂養(高脂飼料配方：基礎飼料81.8%+膽固醇2%+豬油6%+蛋黃粉10%+膽鹽0.2%)。12周末，從高脂組和正常對照組中隨機各選2只大鼠處死，肝組織病理提示NAFLD模型成功，再將高脂組隨機分為利拉魯肽組9只和安慰劑組9只，2組繼續予高脂飲食，每日分別予皮下注射利拉魯肽0.6 mg/kg[3]和等體積的生理鹽水，對照組繼續普通飼料喂養；期間自由進食水；28周末處死各組大鼠。

1.3.2標本采集及10%肝勻漿制備 28周末，稱取各組大鼠體質量，麻醉后取血，分離血清，分裝并貯存備用，后取肝臟稱重，計算肝指數[肝指數(%)=肝重/大鼠體質量×100%]；稱取肝組織100 mg，剪碎置于研磨器中，按比例加入勻漿介質(m:v=1 g:9 ml)，充分勻漿，3 000 r/min離心10 min，上清液即為10%肝勻漿。

1.3.3血清空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、空腹胰島素(fasting insulin, FINS)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、甘油三酯(triglyceride, TG)、膽固醇(cholesterol, CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein, HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein, LDL-c )、ADP及肝勻漿TG、CHO、游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)、MDA、TNF-α、SOD、ADP指標測定 生化分析儀檢測FBG、FINS、ALT、TG、CHO、HDL-c、LDL-c；分光光度計檢測FFA，酶聯免疫吸附法測定ADP、SOD、TNF-α、MDA的含量；生物化學法檢測肝組織TG、CHO；計算胰島素抵抗指數(homeostasis assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。

1.3.4肝組織HE染色 剪取相同部位肝組織塊，固定后脫水、石蠟包埋、冰凍切片、HE染色，再置于光鏡下觀察，毎張切片觀察5個視野。

1.3.5實時PCR檢測肝組織ERp46 mRNA表達 稱取50 mg肝組織，提取并純化總RNA，多功能酶標儀測定RNA樣本濃度并稀釋至500 ng/μl，然后進行逆轉錄和擴增。以GAPDH進行標準化，制成標準曲線；反應結束后分析產物溶解曲線，再運用2-△△Ct法分析數據。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。GAPDH上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′；下游引物5′-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3′；ERp46上游引物5′-CAGACGTCACCATCGCAGAA-3′；下游引物5′-GCGCAGAACAAAGCTGTGTAGA-3′。

1.3.6Western blot檢測肝組織ERp46蛋白表達 稱取相同部位肝組織100 mg，置于研磨器中，充分剪碎，按比例加入PMSF細胞裂解液(100 mg ∶1 000 μl)，充分勻漿，12 000 r/min離心10 min，BCA法測定總蛋白濃度。 取含總蛋白約50 μg的樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜后封閉2 h，然后分別加入兔抗ERp46(1 ∶1 000)及兔抗GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，洗膜后加入抗兔IgG(1 ∶5 000)，于室溫搖床孵育2 h，洗膜后顯影，Western自動曝光機曝光，用Image J軟件分析蛋白條帶。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、肝指數及血清指標變化3組大鼠FBG、HDL差異無統計學意義；安慰劑組大鼠體質量、肝指數、HOMA-IR、FINS、ALT、TG、CHO、LDL-c較正常對照組均升高(P<0.01),大鼠血清ADP較正常對照組降低(P<0.01)；利拉魯肽干預16周后，大鼠體質量、肝指數、HOMA-IR、FINS、ALT、TG、CHO、LDL-c較安慰劑組下降(P<0.01)，血清ADP較安慰劑組升高(P<0.01)；利拉魯肽組與正常對照組大鼠體質量、肝指數、HOMA-IR、FINS、ALT、TG、CHO、LDL、ADP差異無統計學意義。見表1。

2.2 各組大鼠肝勻漿指標變化安慰劑組大鼠肝勻漿TG、CHO、FFA、MDA、TNF-α較正常對照組均增高(P<0.01)，ADP、SOD降低(P<0.01)；利拉魯肽組TG、CHO、FFA、MDA、TNF-α較安慰劑組均下降(P<0.01)，ADP、SOD 升高(P<0.01)；利拉魯肽組與正常對照組TG、CHO、FFA、MDA、TNF-α、ADP、SOD差異無統計學意義。見表2。

2.3 各組大鼠肝組織病理學變化正常對照組：肝小葉結構正常，肝細胞索正常，肝細胞未見氣球樣變性；安慰劑組：肝小葉結構及肝細胞索紊亂，肝細胞見大泡樣脂肪空泡變性，細胞核部分被擠壓變形，少部分消失，肝竇狹窄或消失，炎性細胞浸潤；利拉魯肽組：肝小葉結構及絕大部分肝細胞基本正常，可見極少量肝細胞脂肪空泡變性，細胞核被擠壓變形，見圖1。

2.4 肝組織ERp46 mRNA及蛋白的表達與正常對照組相比，安慰劑組大鼠肝組織ERp46 mRNA及蛋白表達降低(P<0.01，P<0.05)，而利拉魯肽組ERp46 mRNA及蛋白水平較安慰劑組升高(P<0. 01),見圖2。

表1 各組大鼠體質量、肝指數及血清指標變化

與正常對照組比較：**P<0.01；與安慰劑組比較：##P<0.01

表2 各組大鼠肝勻漿指標變化

與正常對照組比較：**P<0.01；與安慰劑組比較：##P<0.01

圖1 各組大鼠肝組織病理學變化 HE×200A：正常對照組；B：安慰劑組；C：利拉魯肽組

圖2 利拉魯肽對大鼠肝組織ERp46 mRNA及蛋白表達影響A：各組大鼠肝臟 ERp46 mRNA表達水平；B： 各組大鼠肝臟 ERp46 蛋白表達水平；C:正常對照組；P：安慰劑組；L：利拉魯肽組；與正常對照組比較： *P<0.05，**P<0.01；與安慰劑組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5 肝組織ERp46表達水平與ADP及氧化應激指標的相關性分析肝組織ERp46表達與血清及肝勻漿ADP水平呈正相關(r1=0.877,P<0.01；r2=0.911,P<0.01)，與SOD水平呈正相關(r=0.860,P<0.01)，與MDA、FFA及TNF-α均呈負相關(r1=-0.908,P<0.01；r2=-0.921,P<0.01；r3=-0.857,P<0.01)。

3 討論

GLP-1是腸促胰島素中有重要生理功能的一種肽類激素，具有降糖、調脂、減重、影響胰島素信號轉導通路等作用。利拉魯肽是GLP-1類似物，與天然GLP-1擁有97%的同源性，因而具備GLP-1全部生理作用。研究[2]表明，GLP-1受體激動劑可改善肝臟的脂肪變性及氧化應激，對NAFLD起到顯著改善作用。本研究中，安慰劑組大鼠體質量、肝指數、HOMA-IR、血清TG、CHO、LDL、ALT及肝勻漿TG、CHO、FFA均增高，利拉魯肽干預后，NAFLD大鼠脂質代謝紊亂減輕，且與對照組差異無統計學意義，表明利拉魯肽具有降脂、減重，改善胰島素抵抗作用，與文獻[2-3]研究結果一致。

SOD是重要的抗氧化物酶，為清除體內自由基的首要物質。MDA為脂質的一種氧化終產物。SOD和MDA可聯合用來評價細胞的氧化應激水平[4]。TNF-α是重要的促炎癥因子，TNF-α水平升高是NAFLD發生發展的獨立危險因素。利拉魯肽能減輕TNF-α誘導的人內皮細胞氧化應激和炎癥反應[5]。本研究中，安慰劑組SOD下降，MDA和TNF-α升高，而利拉魯肽組SOD升高，MDA和TNF-α下降，細胞損害減輕，且與對照組差異無統計學意義，表明利拉魯肽能明顯改善NAFLD氧化應激及脂質過氧化。

ADP是由成熟脂肪細胞分泌，有多種生物學作用的特異性蛋白。研究[6]顯示，ADP水平與肥胖、胰島素抵抗、冠心病及NAFLD密切相關，具有改善糖脂代謝及抗炎等作用。GLP-1受體激動劑能顯著提高NAFLD小鼠血清ADP水平，逆轉肝臟脂肪變性或改善胰島素抵抗[7]。本研究中，安慰劑組ADP水平降低，利拉魯肽組血清和肝臟中ADP水平均升高，與對照組相比差異無統計學意義，說明ADP可能參與了利拉魯肽的抗氧化和抗炎作用。

ERp46是內質網PDI家族成員之一，能促進蛋白質折疊和二硫鍵的形成，在肝細胞、漿細胞及內皮細胞等表達較高。研究[8]表明，利拉魯肽能夠上調糖尿病大鼠胰島中ERp46 mRNA及蛋白的表達，可與ADP受體結合，調控ADP信號通路轉導，在糖尿病和胰島素抵抗的發病中發揮重要的作用[9]。另外，ERp46又可抑制內質網應激[10]。在肝組織中，利拉魯肽可通過抑制肝內質網應激改善胰島素抵抗，減輕NAFLD大鼠氧化應激損傷[11-12]。本研究中安慰劑組大鼠，肝組織ERp46表達均下降，利拉魯肽組ERp46的表達上調，與對照組差異無統計學意義，同時肝組織ERp46表達與ADP及SOD水平呈正相關，與MDA、FFA及TNF-α呈負相關，因此，利拉魯肽改善NAFLD的另一機制可能是通過上調肝組織ERp46表達和脂聯素水平，改善內質網應激，減輕氧化應激損傷，保護肝細胞。其中ERp46蛋白表達的下調機制仍有待進一步研究。

綜上，利拉魯肽改善NAFLD的作用可能與上調ERp46蛋白表達和脂聯素水平，改善內質網應激，減輕氧化應激損傷密切相關。