La-related蛋白1在膽囊癌疾病進展中作用的研究

方德寶，黃大可，江 飛，余宏鑄,4

膽囊癌是膽道系統惡性腫瘤中較常見、最具侵襲性的一種[1]。在中國，膽囊癌發病率約占新發腫瘤病例的1.37%,其發病率高達3.82/100 000[2]。因為無特異性的癥狀、診斷發現遲、缺乏有效的治療方式和預后指標，膽囊癌的預后不盡如人意。流行病學統計顯示膽囊癌的總體生存期約為6個月，5年生存率低于10%[3]。因此，研究膽囊癌的發病機制具有重要的理論和臨床意義。La-related蛋白1(La-related pretein 1,LARP1)是一種RNA結合蛋白。LARP1是5′TOP mRNA翻譯的關鍵調控因子[4]，并在細胞內mTOR活性的響應中作為磷酸化感應分子開關調控核糖體mRNA翻譯和核糖體生物效應[5]。它通過腫瘤信號通路中mTOR等基因的轉錄后調控參與了腫瘤的進展[6-7]。但目前LARP1在膽囊癌中的表達情況及其臨床價值尚不明確，現通過檢測LARP1在非疾病膽囊、膽囊腺瘤和膽囊癌組織中的表達水平；統計分析3組組織標本中LARP1的表達差異以及LARP1表達水平與膽囊癌患者臨床病理資料和預后的關系，探討LARP1在膽囊癌疾病發展中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2011年1月～ 2016年11月經安徽醫科大學第一附屬醫院病理科確診的膽囊癌組織標本76例，膽囊腺瘤組織標本21例，肝血管瘤聯合膽囊切除的非疾病膽囊組織標本27例。采用切片機以4 μm厚度進行連續切片制成組織切片，所得的組織切片均經過病理科醫師診斷。電話隨訪膽囊癌病例至2018年11月，獲得完整隨訪52例，隨訪1～24個月。76例膽囊癌患者中，男24例，女52例；年齡36～88(63.91±11.94)歲；G1-G2(高-中分化)者51例，G3-G4(差-未分化)者25例；腫瘤TNM分期：0-Ⅰ期20例，Ⅱ-ⅢB期56例。腫瘤的TNM分期和組織分級依據美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)膽囊癌分期[8]。本研究經醫院倫理委員會的批準。

1.2 試劑LARP1多克隆一抗購自英國abcam公司；鼠抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司；檸檬酸抗原修復液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、內源性過氧化氫酶阻斷劑、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑盒、蘇木精染色液、中性樹膠購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 研究方法免疫組化(streptAvidin-biotincomplex,SABC)法測定每組組織標本LARP1的表達水平，并以細胞胞質中有明顯黃色/棕黃色顆粒判定為陽性細胞。在Nikon Eclipse 8ic顯微鏡下，每張切片隨機選取5個400倍不連續視野，用Nikon Digital camera攝像并保存待測量圖片，Image Pro Plus 6.0圖像分析系統測量所得圖片中LARP1染色的平均光密度(optical density, OD)值，取平均OD值作為測量值。

1.4 統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)處理，實驗數據以M(P25,P75)表示，多組間采用Kruskal-Wallis H檢驗分析，兩組間差異采用Mann-Whitney U檢驗分析。分類資料采用卡方檢驗分析。應用Kaplan-Meier法計算累積生存率，生存率差異比較采用Log-rank檢驗。應用Cox回歸進行單因素及多因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LARP1在非疾病膽囊組、膽囊腺瘤組和膽囊癌組中的表達LARP1在非疾病膽囊組、膽囊腺瘤組和膽囊癌組中表達的平均OD值呈進行性增高，3組間比較和各兩組間比較的差異均有統計學意義(圖1、表1)。非疾病膽囊或膽囊腺瘤與膽囊癌組間的年齡差異有統計學意義(表1)。

2.2 LARP1的表達水平隨膽囊癌疾病進展逐漸增高LARP1蛋白在T2-T4期膽囊癌原發灶中的表達水平明顯高于Tis-T1期，兩組間差異有統計學意義(Z=-2.177,P=0.029)；在進展期膽囊癌亞組(TNM Ⅱ-ⅢB期)中表達水平明顯高于早期膽囊癌亞組(TNM 0-Ⅰ期)，兩組間差異有統計學意義(Z=-2.361,P=0.018)。另外，LARP1在G3-G4(差-未分化)亞組的表達水平高于G1-G2(高-中分化)亞組，兩者差異有統計學差異(Z=-2.849,P=0.004),見表2。

2.3 LARP1與膽囊癌預后的關系Kaplan-Meier analysis 提示的膽囊癌LARP1高表達亞組(OD值≥0.294)的術后生存期低于低表達亞組，差異有統計學意義(Log Rank=7.132,P=0.008)，LARP1高表達亞組的術后中位生存期為5個月，而LARP1低表達亞組的術后中位生存期為18個月(圖2)；膽囊癌亞組TNM Ⅱ-ⅢB期的術后生存期明顯短于膽囊癌亞組TNM 0-Ⅰ期，差異有統計學意義(Log Rank=18.972,P<0.001)(圖3)。Cox proportional hazard regression model單因素分析提示LARP1表達上調、原發灶(T)分期、TNM分期和組織學分級是膽囊癌術后之預后的危險因素，進一步的多因素分析表明LARP1表達上調、TNM分期和組織學分級是影響膽囊癌預后的獨立因素(表3)。

與膽囊腺瘤組比較:*P<0.05;與膽囊癌組比較:#P<0.05; 與膽囊癌組比較：**P<0.05;與膽囊癌組比較:##P<0.05;與膽囊癌組比較:△P<0.05

表2 膽囊癌各臨床病理亞組中LARP1的表達情況

變量nLARP1表達的平均OD值M(P25,P75)ZP年齡(歲)[4]-0.7220.470 <60490.296(0.209,0.368) ≥60270.291(0.215,0.359)性別-1.2890.197 男240.280(0.209,0.379) 女520.267(0.208,0.335)原發灶(T)[4]-2.1770.029 Tis-T1220.227(0.191,0.336) T2-T4540.309(0.250,0.388)區域轉移淋巴結(N)[4]-0.4080.683 N0520.275(0.207,0.384) N1240.303(0.232,0.361)TNM分期[4]-2.3610.018 0-Ⅰ200.226(0.330,0.165) Ⅱ-ⅢB560.309(0.250,0.385)組織學分級[4]-2.8490.004 G1-G2(高-中分化)510.270(0.201,0.335) G3-G4(差-未分化)250.336(0.266,0.427)

表3 單因素及多因素Cox回歸模型分析影響術后生存時間的因素

3 討論

闡述膽囊癌發生的膽囊腺瘤-膽囊癌假說在形態學[9]和DNA測序研究[10]中都得到了驗證。近期的研究[11]提示：在年輕韓國膽囊癌患者的腫瘤形成中，膽囊腺瘤-膽囊癌假說較化生-異常增生-膽囊癌假說扮演著更為重要的角色。本實驗基于正常膽囊-膽囊腺瘤-膽囊癌假說，利用免疫組化的方法檢測了手術病理確診的非疾病膽囊、膽囊腺瘤和膽囊癌3組石蠟標本組織中LARP1的表達水平，統計分析了3組LARP1表達水平的差異，結果發現LARP1在非疾病膽囊組、膽囊腺瘤組和膽囊癌組中的表達水平呈進行性增高，差異有統計學意義。這提示LARP1可能參與了膽囊癌的發生。本實驗中膽囊癌組與非疾病膽囊組或膽囊腺瘤組組間的年齡差異有統計學意義，提示年齡可能是1個膽囊癌發病的危險因素。1份近期的大樣本統計也提示膽囊癌的發病率隨年齡的增長而增高，其中40.5%的患者年齡≥75歲[12]。

圖2 膽囊癌不同LARP1表達水平亞組的術后生存曲線

圖3 膽囊癌不同TNM分期亞組的術后生存曲線

T分期[13-14]和組織學分級[15]是膽囊癌的兩個重要預后因素，本實驗對不同TNM分期和組織學分級亞組的膽囊癌組織中LARP1表達水平進行了檢測和統計分析。結果發現：LARP1在膽囊癌亞組TNM Ⅱ-ⅢB期中表達水平明顯高于膽囊癌亞組TNM 0-Ⅰ期(Z=-2.361,P=0.018)；同樣在G3-G4亞組中的表達水平高于G1-G2亞組(Z=-2.849,P=0.004)。這提示LARP1可能參與了膽囊癌的進展。對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的研究發現：與正常對照細胞相比，NSCLC細胞中LARP1的m-RNA水平增加；敲除LARP1可抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲；而且非小細胞肺癌組織中LARP1的過表達與腫瘤進展和不良生存相關。

在直腸癌[16]中，LARP1表達升高與腫瘤的TNM分期和分化程度相關，敲除LARP1可抑制CRC細胞的增殖；多因素分析提示LARP1是影響直腸癌總生存率的獨立預后因素。為了解LARP1表達水平與膽囊癌患者術后生存時間之間的關系，課題組根據LARP1表達水平的不同將患者分為高表達亞組和低表達亞組，并以此制作了Kaplan-Meier生存曲線。結果表明LARP1表達越高的患者術后生存時間越短，而且2組間差異有統計學意義(Log Rank=7.132,P=0.008)。進一步的單因素和多變量COX回歸統計分析顯示LARP1、TNM分期和組織學分級是影響膽囊癌術后之生存時間的獨立危險因素。

綜上所述，LARP1作為一種潛在的生物標志物，為膽囊癌的診斷和預后分析提供了新的手段，為膽囊癌的治療提供了新的見解和研究思路，但如何有效調控LARP1細胞內表達的具體機制，尚需要進一步的探索。