Nrf2蛋白在中波紫外線照射HaCaT細胞中的光保護作用

林芳 馬良娟 張曉卉 柏冰雪

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院皮膚科 150000

林芳現在滄州市中心醫院皮膚科，河北 061000

紫外線照射是急性皮膚光損傷、慢性光老化和光致癌作用的主要致病因素。中波紫外線（UVB）照射是造成皮膚光損傷的主要原因［1］。UVB主要作用于表皮角質形成細胞，產生氧化應激反應，并誘發機體皮膚炎癥，從而造成角質形成細胞氧化損傷［2］。核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor-2，Nrf2）是一種抗氧化反應的主要調節因子［3］，在氧化應激狀態下與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合成為Nrf2/ARE通路，可以清除體內活性氧，抑制炎癥，保護細胞免受氧化應激損傷。據報道，一些具有光保護作用的物質能夠通過激活Nrf2及Nrf2/ARE通路減輕氧化應激反應，延緩光損傷［4-5］。我們建立UVB光損傷的人永生化角質形成細胞（HaCaT）模型，并對HaCaT細胞感染Nrf2增強基因慢病毒，增強細胞內Nrf2蛋白的表達，在細胞水平上研究Nrf2在皮膚角質形成細胞光損傷中的保護作用。

材料與方法

一、材料與儀器

Nrf2增強基因慢病毒（上海漢恒生物公司）。人永生化角質形成細胞（HaCaT）由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗室提供。DMEM細胞培養液、胎牛血清、CCK8細胞增殖毒性檢測試劑盒（日本同仁化學研究所），DHE超氧化物陰離子熒光探針（上海碧云天公司），超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），人腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）ELISA 測定試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），Nrf2兔抗人抗體、β肌動蛋白抗體、辣根酶標記的山羊抗兔Nrf2抗體（上海碧云天公司），UVB燈管（南京華強電子有限公司）、電泳儀、iMark酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

二、方法

1.細胞培養與分組：復蘇HaCaT細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、5%CO2下培養，每1～2 d換液，取3～5代HaCaT細胞，分為對照組（不轉染，不照射）、UVB組（不轉染，照射）、Nrf2組（轉染，不照射）、Nrf2+UVB組（轉染，照射）。本文所有實驗均重復3次。

圖1 倒置熒光顯微鏡下HaCaT細胞轉染帶有熒光標記的Nrf2增強基因后的熒光情況（×200） 4組細胞的轉染效率分別為10%、50%、70%、90%

2.Nrf2增強基因慢病毒轉染預實驗：取3～5代HaCaT細胞，于96孔培養板中每孔接種3 000～5 000個細胞，加入100 μl培養基，培養箱過夜。細胞分為4組，用不含胎牛血清的完全培養基培養24 h。稀釋病毒原液轉染細胞，每組細胞的感染復數（MOI，multiply of infection）值（指每個細胞感染的病毒數）分別設為10、20、50、100，轉染后培養12 h，觀察細胞狀態，無明顯異常時，繼續培養24 h，更換培養基，轉染48 h時，觀察轉染效率。該慢病毒帶有綠色熒光蛋白報告基因，可通過熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白表達效率，得到細胞轉染效率。結果顯示，MOI值為20時，細胞轉染效率約為50%，實驗可行性及經濟價值最合適。

3.感染Nrf2增強基因慢病毒及UVB照射：取3～5代HaCaT細胞，根據預實驗條件，進行慢病毒轉染，感染48 h后，觀察熒光情況，根據細胞生長情況及時換液、傳代及凍存，待用。細胞感染Nrf2增強基因慢病毒或照射UVB后，繼續培養24 h進行后續實驗，并在非熒光倒置光鏡下觀察細胞形態、數目及細胞狀態。UVB光源距細胞15 cm，照射30 s，總劑量為30 mJ/cm2。對照組、Nrf2組細胞注意避光。

4.CCK8試劑盒檢測細胞活力：按試劑盒說明書操作處理上述4組細胞，采用酶標儀于450 nm波長處測定各組細胞的吸光度（A值）。細胞活力=（實驗孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。

5.TNF-α、IL-6、SOD含量的測定：取上述4組細胞，按TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組細胞培養上清液中TNF-α和IL-6含量。取上述4組細胞，按SOD測定試劑盒說明書操作，測定各組細胞SOD酶活力單位（U/mg）。

6.Western印跡檢測Nrf2蛋白水平：取上述4組細胞，冰上裂解后，于4℃下12 000 r/min離心10 min（離心半徑7 cm），收集上清液，根據BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，測量各組蛋白濃度。各組蛋白樣品經電泳、轉膜、封閉后，加入Nrf2一抗（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜或室溫孵育1 h，洗膜3次，加入二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h，棄二抗，洗膜3次，加適量預混ECL發光液顯影，置于Chem Scope 6000系列化學發光成像機器，采集圖像。分析條帶信息，目的基因相對表達值為目的基因條帶與β肌動蛋白基因條帶灰度值的比值。

7.細胞活性氧（ROS）的檢測：取上述4組細胞，加入含5 μmol/L超氧化物陰離子熒光探針（DHE）2 μl，于37℃細胞培養箱內孵育20 min，采用無血清培養基洗滌3次，除未進入細胞的DHE。設置空白對照組。使用流式細胞儀于535 nm激發波長和610 nm發射波長檢測細胞熒光強度。相對ROS含量=處理組熒光強度/空白對照組熒光強度×100%。

結 果

一、細胞轉染情況

倒置熒光顯微鏡下，MOI值10、20、50、100組細胞的轉染效率約為10%、50%、70%、90%。見圖1。

二、UVB照射前后HaCaT細胞的形態學變化

倒置顯微鏡下，正常的HaCaT細胞為多角形，呈簇集狀生長，生長狀態良好；照射30 mJ/cm2UVB后繼續培養24 h時，HaCaT細胞出現皺縮、變圓，漂浮細胞數增多，貼壁數量明顯減少。見圖2。

三、感染Nrf2增強基因慢病毒對HaCaT細胞Nrf2蛋白水平的影響

圖2 照射中波紫外線對HaCaT細胞形態的影響（×200）2A：正常細胞為多角形，呈簇狀生長，生長良好；2B：照射后繼續培養24 h，細胞出現皺縮、變圓，漂浮細胞數增多，貼壁數量明顯減少

對照組、UVB 組、Nrf2組、Nrf2+UVB組Nrf2蛋白相對表達水平分別為1.84±0.05、0.63±0.08、2.19±0.17、1.43±0.07，差異有統計學意義（F=64.81，P ＜ 0.05），Nrf2組高于對照組（t=14.82，P ＜0.05），UVB組水平低于對照組（t=12.49，P ＜ 0.05）和Nrf2+UVB組（t=7.47，P＜0.05）。見圖3。

四、感染Nrf2增強基因慢病毒及照射UVB對HaCaT細胞活力的影響

對照組、UVB組、Nrf2組、Nrf2+UVB組細胞活力差異有統計學意義（P＜0.05），UVB組低于對照組（t=33.34，P ＜ 0.05）和Nrf2+UVB組（t=10.07，P＜0.05）。見表1。

五、感染Nrf2增強基因慢病毒及照射UVB對HaCaT細胞SOD水平的影響

對照組、UVB組、Nrf2組、Nrf2+UVB組SOD水平差異有統計學意義（P＜0.05），UVB組低于對照組（t=11.25，P ＜0.05）和Nrf2+UVB組（t=17.52，P＜0.05）。見表1。

圖3 Western印跡檢測感染Nrf2增強基因慢病毒及照射中波紫外線（UVB）對HaCaT細胞內Nrf2蛋白水平的影響 1～4：分別為對照組、UVB組、Nrf2組、Nrf2+UVB組。UVB組Nrf2蛋白相對表達水平低于對照組和Nrf2+UVB組

六、感染Nrf2增強基因慢病毒對UVB照射后HaCaT細胞的炎癥因子IL-6、TNF-α的影響

對照組、UVB 組、Nrf2組、Nrf2+UVB組IL-6水平差異有統計學意義（P＜0.05），而TNF-α水平差異無統計學意義（P=0.189）。UVB組IL-6水平高于對照組（t=28.48，P＜0.05）和Nrf2+UVB組（t=27.82，P ＜ 0.05）。見表1。

七、感染Nrf2增強基因慢病毒對UVB誘導的HaCaT細胞相對ROS含量的影響

對照組、UVB組、Nrf2組、Nrf2+UVB組相對ROS含量差異有統計學意義（P＜0.05），UVB組高于對照組（t=33.68，P＜0.05）和Nrf2+UVB組（t=12.47，P ＜ 0.05）。見表1、圖4。

討 論

紫外線可導致皮膚損傷，其中UVB能量最高，直接照射于皮膚表皮角質形成細胞時，可產生過多ROS并引起一系列的氧化應激反應，ROS與體內的生物分子如蛋白質、脂質和核酸相互作用，加速皮膚光老化［6］，最終導致各種皮膚損傷。研究顯示，Nrf2及其通路通過介導細胞氧化應激損傷，降低炎癥信號傳導，增加DNA修復和抗氧化劑反應［7-8］，達到對表皮細胞光保護的作用。本研究也發現，UVB照射可引起HaCaT細胞受損，我們采用UVB照射HaCaT細胞后繼續培養24 h，發現貼壁細胞明顯減少，細胞出現皺縮、變圓，死亡的細胞增多。我們通過對HaCaT細胞轉染慢病毒包裝的Nrf2增強基因，發現提高Nrf2表達水平可減輕UVB照射對HaCaT細胞的損傷。

表1 感染Nrf2增強基因慢病毒及照射UVB對HaCaT細胞活力及SOD、IL-6、TNF-α、ROS水平的影響（±s）

表1 感染Nrf2增強基因慢病毒及照射UVB對HaCaT細胞活力及SOD、IL-6、TNF-α、ROS水平的影響（±s）

注：n=3。UVB：中波紫外線；SOD：超氧化物歧化酶；IL-6：白細胞介素6；TNF-α：腫瘤壞死因子α；ROS：相對活性氧

組別對照組UVB組Nrf2組Nrf2+UVB組F值P值細胞活力（%）98.00±2.39 24.40±2.98 71.63±3.39 43.38±3.39 64.81＜0.05 SOD水平（U/mg）228.02±15.68 114.04±7.85 321.29±13.96 150.84±9.42 170.76＜0.001 IL-6水平（ng/L）758.32±223.30 6 510.12±269.25 1 540.04±90.73 5 592.95±235.47 532.34＜0.001 TNF-α水平（ng/L）215.85±31.10 243.73±48.53 178.09±38.70 183.13±27.28 2.02 0.189相對ROS含量（%）1.27±0.10 5.65±0.19 2.10±0.73 3.67±0.19 481.39＜0.001

圖4 流式細胞儀檢測感染Nrf2增強基因慢病毒對中波紫外線誘導的HaCaT細胞活性氧（ROS）水平的影響 UVB組ROS相對水平高于對照組和Nrf2+UVB組

HaCaT細胞在感染Nrf2增強基因慢病毒后，Western印跡顯示，細胞內Nrf2水平顯著升高，說明Nrf2增強基因的轉染成功，UVB組Nrf2水平低于對照組，提示感染Nrf2增強基因慢病毒可緩解UVB照射對降低HaCaT細胞Nrf2水平的影響。Nrf2作為抗氧化反應的主要調節因子，在氧化應激狀態下與ARE結合成為Nrf2/ARE通路，兩者同時對機體細胞內的氧化應激狀態進行調節，可以進行炎癥信號傳導，DNA修復和抗氧化劑反應。本研究通過CCK8法測得各組細胞生存率顯示，UVB照射后細胞生存率低于對照組，但感染Nrf2增強基因慢病毒后，Nrf2+UVB組細胞存活率較UVB組升高，表明感染Nrf2增強基因慢病毒能夠提高UVB誘導的HaCaT的生存率。我們還通過檢測HaCaT細胞的ROS熒光強度發現，UVB組細胞產生ROS增多，而與UVB組相比，Nrf2+UVB組ROS產生量減少。這些結果提示，轉染Nrf2基因通過抑制細胞內ROS的產生，提高UVB照射后HaCaT細胞的存活率。在正常情況下，人體內有諸多受Nrf2/ARE通路調控抗氧化的酶，如SOD、谷胱甘肽硫轉移酶、血紅素氧合酶1等，可有效地對抗機體內的氧化應激損傷。SOD有特定生物催化功能，可清除自由基及炎癥因子，對細胞的光損傷有一定的保護作用。本研究發現，UVB照射可使細胞內SOD活力顯著降低，表明UVB照射加快HaCaT細胞的氧化損傷，而轉染Nrf2過表達基因后SOD活力上升，提示Nrf2可提高細胞內抗氧化酶水平，增加抗氧化應激能力。

作為重要的免疫器官，皮膚在受外界刺激（如紫外線照射）后會激活一系列氧化應激通路，產生多種炎癥因子。紫外線誘發的皮膚炎癥過程中主要產生IL-6、IL-8及TNF-α，IL-6可加速基質金屬蛋白酶1的分泌，刺激表皮增生，與多種皮膚炎癥相關，如特應性皮炎、銀屑病和光老化等疾病。TNF-α主要由單核細胞和巨噬細胞產生，且能進一步誘導表皮細胞產生 IL-2、IL-6，加重炎癥反應［9］。Saw等［10］對Nrf2基因敲除小鼠和Nrf2基因野生型小鼠使用Nrf2活化劑后照射UVB，發現野生型小鼠比Nrf2基因敲除小鼠更容易將曬傷細胞的數量、炎癥因子恢復到它們的基礎水平。本研究顯示，經UVB照射后，HaCaT細胞培養上清液中的IL-6含量高于對照組，而Nrf2+UVB組的IL-6生成量少于UVB組，提示Nrf2可抑制IL-6的分泌，減輕UVB照射引起的炎癥反應及細胞損傷。本研究也檢測了另外一種常見的炎癥因子TNF-α，發現照射UVB與感染Nrf2增強基因慢病毒對HaCaT細胞TNF-α的分泌無明顯影響，其原因仍有待研究。

本實驗證實，UVB照射能造成體外培養的HaCaT細胞損傷，而Nrf2在細胞的光損傷中具有保護作用，這種保護作用可能與其抗氧化應激通路密切相關。本實驗為Nrf2基因激動劑及激活Nrf2通路對抑制紫外線造成的光損傷的保護作用提供了一定的理論依據，有望用于臨床。但本實驗結果僅是在細胞及分子水平的體外研究，且部分抗氧化及體內保護機制尚未完全清楚，有待深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突