水飛薊賓對C2C12細胞胰島素抵抗的影響及機制研究＊

秦 帥 ，吳麗麗 ，秦靈靈 ，張程斐 ，吳呦呦 ，孫伯菊 ，劉銅華 ，＊＊

（1. 成都中醫藥大學臨床醫學院 成都 610036；2. 北京中醫藥大學教育部中醫養生學重點實驗室 北京 100029；3. 北京中醫藥大學東方醫院 北京 100078）

由于環境污染、久坐缺乏運動、高熱卡飲食、人口老齡化等因素的影響使得2 型糖尿?。╰ype 2 diabetic mellitus，T2DM）在全世界范圍流行。第9 版《全球糖尿病地圖（IDF Diabetes Atlas）》顯示全球現有糖尿病患者4.63 億人，預計到2030 年，該數字將達到5.78億[1，2]。而我國更成為糖尿病患者最多的國家。T2DM作為全球流行的主要慢性代謝性疾病之一，其發病核心病機是胰島素抵抗和胰島β細胞功能不足。T2DM的發生與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）密切相關，IR 貫穿T2DM 的整個過程。因此從天然植物中發現可改善胰島素抵抗的藥物成為研究熱點。

水飛薊賓是從植物水飛薊（Silybum marianum）中提取的水飛薊素的黃酮木脂素成分。臨床常用其抗氧化和保肝特性治療肝功能異常疾病[3]。近年來越來越多的研究發現其具有抗肥胖、降脂、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化，防治糖尿病并發癥等作用[4-7]。作為葡萄糖攝取和儲存的主要部位，骨骼肌攝取的葡萄糖約占全身葡萄糖攝取總量的75%[8]。近年來研究發現肌肉組織胰島素抵抗與STAT3 的磷酸化水平及SOCS3 蛋白表達水平與呈正相關。由棕櫚酸鈉暴露導致L6 肌管中STAT3 的磷酸化，同時SOCS3 的蛋白豐度增加產生胰島素抵抗，而STAT3 基因沉默可降低SOCS3 蛋白水平，并改善胰島素抵抗[9]。研究發現水飛薊賓作為STAT3 的抑制劑應用于癌癥、免疫性等疾病的治療[10，11]。但水飛薊賓能否可以通過抑制STAT3/SOCS3信號通路改善肌肉組織胰島素抵抗尚不明確。本研究應用C2C12 成肌細胞為模型，研究水飛薊賓對C2C12胰島素抵抗的影響，并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

R200D 型分析天平（德國賽多利斯），Sigma 臺式高速低溫冷凍離心機（Sigma-Aldrich 公司），HDL 型超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司），HERA Cell 150i CO2 孵育箱（美國Thermo Scientific），酶標儀（美國 Promega 公司），IX71 倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 實驗細胞

C2C12細胞株由北京中醫藥大學教育部中醫養生學重點實驗室提供。

1.3 主要試劑及材料

水飛薊賓（上海源葉生物技術有限公司，純度＞98%），DMEM 高糖培養基（美國Gibco），青霉素-鏈霉素混合液（Biotopped），胎牛血清（foetal bovine serum，FBS，ORIGIN 公司），馬血清（天津康源生物技術有限公司），胰蛋白酶-EDTA 溶液（Biotopped），二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO，北京Solarbio），棕櫚酸（北京Solarbio），葡萄糖測試盒（南京建成生物工程研究所），細胞計數試劑盒CCK-8（日本同仁化學），全蛋白提取試劑盒（強）（北京Solarbio），BCA蛋白定量試劑盒（北京 Solarbio）；TNF-α，IL-β及 IL-10 ELISA 檢測試劑盒（上海優維寧生物有限公司），抗體P-STAT3、SOCS3、β-actin（美國 CST），Blocking one 及 Blocking one-P（日本Nacalai Tesque），30%蛋白凝膠溶液（北京拜爾迪生物技術有限公司），Solution1（日本TOYOBO），Solution2（日本TOYOBO），96及6孔細胞培養板（美國Corning）。

2 方法

2.1 C2C12細胞培養

用含10%FBS 和1%青-鏈霉素的DMEM 培養基，放置于37℃，5%CO2 的細胞培養箱中培養，隔日更換1 次培養液，待細胞密度覆蓋培養皿80-90%時，用胰蛋白酶溶液消化2 min，1:3 傳代2-3 次后用于后續實驗。

2.2 水飛薊賓對C2C12細胞增殖能力的影響

實驗設空白組、正常組、對照組（含DMSO 100μg·mL-1）、不同濃度水飛薊賓藥物處理組（150μmol·L-1、100 μmol·L-1、50μmol·L-1、30 μmol·L-1、20 μmol·L-1、15μmol·L-1、10μmol·L-1、5μmol·L-1），其中空白組為不含藥物及細胞的培養基、正常組為含細胞的完全培養基。將生長至80-90%的C2C12 細胞以3 × 104/mL的密度接種于 96 孔板，200μL/孔，設 6 個復孔，放置細胞培養箱培養24 h后，然后加10μL/孔CCK-8，置于細胞培養箱中反應90 min，置酶標儀中測定吸光度（波長為450 nm），讀取數值。

細胞存活率：存活率=（給藥組/對照組- 空白組）/（正常組-空白組）×100%

2.3 建立C2C12細胞胰島素抵抗模型

將生長至 80-90% 的 C2C12 細胞以 5 × 104/mL 的細胞密度接種于6 孔細胞培養板，2 mL/孔，培養2 天，待細胞融合度達到85%以上時，換用含2%馬血清的DMEM 誘導培養4 天，隔日更換1 次培養液，直至85%以上的成肌細胞分化為肌管即成熟肌細胞。將分化的肌管細胞分為正常組（Normal）和造模組（Control），正常組用含10%胎牛血清的高糖培養基培養，造模組用 0.5 mmol·L-1棕櫚酸造模液培養 16 h[12]。

2.4 水飛薊賓對胰島素抵抗C2C12 細胞葡萄糖攝取能力的影響

采用上述方法建立C2C12 胰島素抵抗模型，棄培養基，用PBS 洗2 次，設正常組、模型組及不同濃度的水飛薊賓組，其中正常組為不含胎牛血清的DMEM 高糖培養基，設6個復孔，放置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養24 h后棄舊培養基，用PBS洗2次，換不含胎牛血清DMEM 培養基培養6 h，用葡萄糖測試盒測定各組C2C12 細胞培養液中葡萄糖含量，進一步計算葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗量=總葡萄糖含量-不同處理組葡萄糖含量。

2.5 水飛薊賓對C2C12 細胞分泌 TNF-α、IL-β 及 IL-10的影響

收集2.4 中各組C2C12 細胞培養液，4℃，800 g，離心10 min，收集上清。用ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-β及IL-10炎性因子水平。

2.6 水飛薊賓對C2C12 細胞P-STAT3、SOCS3 蛋白表達影響

收集2.4 中不同處理組的C2C12 細胞，用全蛋白提取試劑盒提取各組C2C12 細胞總蛋白。用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，加PBS 和2×蛋白上樣緩沖液調整各組蛋白至統一濃度，100℃煮沸5 min 后置-20℃保存備用。

根據蛋白濃度，確定蛋白上樣量為20μg/孔，先80 V 預電泳 10 min，再 100 V 電泳 90 min。將 PVDF 膜置于甲醇中活化1 min，用半干法凝膠轉膜法恒流200 mA 轉膜 30 min，用 1 × TBS 搖床室溫洗 3 次，每次 10 min，Blocking one 或 Blocking one-P 室溫封閉 1 h，分別加 P-STAT3、SOCS3 和β-actin（1∶1000 稀釋）4℃孵育過夜。次日回收一抗，用1×TBST搖床室溫清洗3次，每次10 min，加二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，回收二抗，用1×TBST 搖床室溫清洗3 次，每次10 min。加超敏發光液，避光反應1 min，凝膠成像系統顯影。用Image J軟件對灰度值進行分析。

2.7 數據分析

采用Graphpad Prism 6 統計軟件進行數據分析，數據用平均值±標準差（）來表示。多組間比較采用One-way ANOVA；兩組間比較，當滿足方差齊性時用LSD 檢驗，當不滿足方差齊性時用非參數檢驗；P＜0.05表示有統計學差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

3 結果

3.1 水飛薊賓對C2C12細胞增殖能力的影響

CCK-8 檢測結果顯示（圖1）：當水飛薊賓濃度大于 20μmol·L-1時水飛薊賓影響 C2C12 細胞增殖能力，當濃度在30μmol·L-1時，細胞存活率僅為87.65%，當濃度高于 30μmol·L-1時，C2C12 細胞的生長增殖能力明顯降低，且濃度越高，存活率越低；而當濃度低于30μmol·L-1時，細胞存活率接近于100%，故選5μmol·L-1、10μmol·L-1和 20μmol·L-1濃 度 用 于 后 續 實 驗研究。

3.2 水飛薊賓對胰島素抵抗C2C12 細胞葡萄糖攝取能力的影響

由表 1 知，與 Normal 組比較，Control 組的葡萄糖消耗量明顯降低（P＜ 0.01），說明Control 組C2C12 細胞對葡萄糖的攝取能力下降，成功建立C2C12 細胞胰島 素 抵 抗 模 型 。 而 與 Control 組 比 較 ，5μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1水飛薊賓組均較 Control 組葡萄糖消耗量明顯增加（P＜0.01），且呈劑量依賴性，葡萄糖消耗量分別增加了33.5%、45.3%與67.1%。說明水飛薊賓可增加C2C12 細胞對葡萄糖的攝取能力，改善C2C12細胞胰島素抵抗。

圖1 水飛薊賓對C2C12細胞增殖能力的影響

表1 水飛薊賓對C2C12細胞葡萄糖消耗量的影響（）

表1 水飛薊賓對C2C12細胞葡萄糖消耗量的影響（）

注：與Control 組對比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；Control 組與 Normal 組對比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01（n=6）。

葡萄糖消耗量/（mmol·L-1）4.17±0.30 3.22±0.44##4.30±0.27**4.68±0.29**5.38±0.49**分組Normal組Control組5 μmol·L-1組10 μmol·L-1組20 μmol·L-1組

表2 水飛薊賓對TNF-α、IL-β、IL-10炎性因子的影響（）

表2 水飛薊賓對TNF-α、IL-β、IL-10炎性因子的影響（）

注：與Control 組對比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；Control 組與 Normal 組對比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01（n=6）。

IL-10(pg·mL-1)4.42±0.28 2.91±0.56##3.22±0.40 3.58±0.39*4.03±0.53**分組Normal組Control組5 μmol·L-1組10 μmol·L-1組20 μmol·L-1組TNF-а(pg·mL-1)2.67±0.34 3.48±0.41##3.12±0.33 3.03±0.50*2.97±0.37**IL-β (pg·mL-1)6.07±0.28 11.81±0.69##10.80±0.50 8.35±0.43*7.95±0.49**

3.3 水飛薊賓對C2C12 細胞分泌TNF-α、IL-β、IL-10炎性因子的影響

由表 2 知，與 Nromal 組比較，Control 組 TNF-α和IL-β水平明顯提高（P＜ 0.01），說明Control 組促炎因子水平明顯提高，而抗炎因子IL-10 水平明顯減低（P＜ 0.01）。與 Control 組比較，5μmol·L-1、10μmol·L-1及 20 μmol·L-1水飛薊賓組可降低 Control 組 TNF-α和IL-β水平，并提高IL-10水平，其中20μmol·L-1可顯著減低TNF-α和IL-β水平（P＜ 0.01），同時提高IL-10水平（P＜0.01）。說明水飛薊賓可抑制C2C12 胰島素抵抗模型炎癥因子分泌。

圖2 水飛薊賓對C2C12細胞P-STAT3、SOCS3蛋白的影響

表3 水飛薊賓對C2C12細胞P-STAT3、SOCS3蛋白表達影響（，n=6）

表3 水飛薊賓對C2C12細胞P-STAT3、SOCS3蛋白表達影響（，n=6）

注：與 Control 組對比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；Control 組與 Normal 組對比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

SOCS3/β-actin 0.744±0.042 1.011±0.057##0.951±0.064 0.802±0.050*0.784±0.055**分組Normal組Control組5 μmol·L-1組10 μmol·L-1組20 μmol·L-1組P-STAT3/β-actin 0.445±0.051 0.699±0.062##0.607±0.047 0.588±0.050*0.532±0.046**

3.4 水飛薊賓對C2C12 細胞P-STAT3、SOCS3 蛋白表達的影響

由圖 2 和表 3 知，與 Normal 組比較，Control 組 PSTAT3 和 SOCS3 蛋白水平明顯提高（P＜ 0.01）。與Control 組比較，5μmol·L-1、10μmol·L-1及 20μmol·L-1水飛薊賓組可抑制STAT3 磷酸化水平，進而降低SOCS3蛋白表達水平。

4 討論

作為全世界最主要的慢性非傳染性疾病之一，糖尿病及其并發癥給患者帶來沉重的經濟和心理負擔，嚴重影響患者的生活及生存質量。自從Hotamisligil等[13]報道在肥胖和T2DM 嚙齒動物模型的脂肪組織中存在TNF-α，證明了肥胖、T2DM 和炎癥之間存在聯系。他們證明在肥胖的fa/fa 大鼠中敲除TNF-α可以改善了胰島素敏感性。此外，若敲除TNF-α或TNF 受體的糖尿病模型小鼠可提高胰島素敏感性，降低血糖[14，15]。研究表明多種促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β破壞了肥胖癥的胰島素作用并導致胰島素抵抗[16]。TNF-α通過增強脂肪細胞的脂解作用，調控IKKβ/NF-κB信號通路，同時激活STAT3，增加胰島素受體底物1（IRS1）的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化而引起胰島素抵抗[17]。

IL-10 作為一種重要的抑炎細胞因子，主要由巨噬細胞產生[18]。多項研究表明IL-10 小鼠骨骼肌和成肌細胞中表達，其通過抑制巨噬細胞的活化和阻斷抗原的遞呈以及炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β的釋放和活化來抑制炎癥反應，從而減少全身及肌肉組織等局部炎癥，改善骨骼肌的胰島素信號通路和肌肉組織對葡萄糖攝取及利用，改善胰島素抵抗[19-21]。研究發現若過表達骨骼肌中IL-10可以改善飲食誘導的小鼠胰島素抵抗[22]。

已知STAT 是一個轉錄因子家族，與其他STAT 蛋白相比，STAT3 具有更高的保守性，是最原始、最普遍的STAT 類型[23]。STAT3 的激活可由多種不同類型的刺激引起，如細胞炎癥因子、生長因子、致癌物、氧化應激、感染和輻射。其參與細胞因子和營養物質誘導的胰島素抵抗[24]。研究發現T2DM 患者STAT3 磷酸化水平提高，而升高的P-STAT3 影響骨骼肌胰島素信號轉導和外周組織如肌肉對葡萄糖攝取，從而引起胰島素抵抗[25]。

細胞因子信號傳遞的抑制因子家族（SOCS）最初在1997年被發現，它是一種參與負反饋回路以減弱細胞因子作用的分子[26，27]。在肥胖或者糖尿病患者種，各種組織中SOCS 蛋白的表達升高，這對調節新陳代謝和胰島素敏感性至關重要。其家族中的SOCS1 和SOCS3 在肌肉高表達，可通過競爭胰島素受體上的磷酸酪氨酸結合位點來阻止胰島素誘導的IRS蛋白的激活，從而誘發胰島素抵抗[28，29]。而STAT3 沉默可下調T2DM 患者 SOCS1 和 SOCS3 的蛋白豐度，從而增強IRS-1 和IRS-2 的酪氨酸磷酸化，從而增強Akt信號通路改善胰島素抵抗[30]。

水飛薊賓是一種傳統上用于治療膽囊和肝臟疾病的黃酮寡糖，近年來諸多研究發現水飛薊賓可通過改善胰島β細胞的活性，增加肝臟和肌肉細胞的胰島素敏感性以及減少脂肪細胞中的脂質沉積來改善血糖[31-33]。此外，水飛薊賓還能有效治療糖尿病并發癥，包括神經病變[34]、視網膜病變、愈合障礙[35]、心肌病、腎病和骨質疏松癥等[36-38]。本實驗結果發現水飛薊賓可增加C2C12 胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量，同時抑制促炎因子TNF-α、IL-1β的分泌，提高抑炎因子IL-10分泌，降低P-STAT3和SOCS3蛋白表達。

綜上所述水飛薊賓可能通過抑制TNF-α、IL-1β炎癥因子分泌，促進抑炎因子IL-10 分泌和調控STAT3/SOCS3信號通路來改善C2C12細胞胰島素抵抗。