基于網絡藥理學的佛手干預2型糖尿病潛在靶點機制研究＊

張 磊 ，樸勝華 ＊＊，郭 姣

（1. 廣東藥科大學廣東省代謝病中西醫結合研究中心 廣州 510006；2. 廣東藥科大學廣東省代謝性疾病中醫藥防治重點實驗室 廣州 510006）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是臨床常見的重大慢性疾病之一，其發病機制復雜，目前研究表明主要與氧化應激、慢性炎癥及胰島素抵抗等有關[1-3]。根據國際糖尿病聯盟（International Diabetes Federation，IDF，https://diabetesatlas.org/en/）于 2017 年發布數據顯示，全球約有4.25 億糖尿病成人患者，截至2017 年底，中國國內共有約1.144 億糖尿病患者（20-79 歲），而患病人群以T2DM 為主，占比約93.7%[4]。中醫藥因其多成分多靶點作用，在治療這種病機復雜的T2DM 等代謝性疾病上具有一定的優勢。團隊帶頭人郭姣教授首次整體認識該類疾病，提出癉濁（糖脂代謝病）新理論[5]，依據其“肝失疏泄，五臟六腑皆受其制，濕痰瘀濁內阻”的核心病機，創建“調肝啟樞化濁”法取得顯著效果，貞術調脂方為該法的代表方藥，佛手作為君藥在其中發揮了重要作用[6-8]。

佛手，別名廣佛手、佛手果、佛手柑，為蕓香科植物佛手的果實，味辛、苦、酸，溫，歸肝、脾、胃、肺經，一味藥兼有疏肝理氣，燥濕化痰的功效。其主要化學成分包含多種生理活性物質，如揮發油類、黃酮類、香豆素類、多糖、氨基酸和無機鹽等[9]，多項研究顯示了較好的降低血糖[10]、調節血脂[11]、改善胰島素抵抗[12]等調節糖脂代謝紊亂的作用。Meta 分析臨床運用佛手治療T2DM 療效顯著[13]，臨床試驗[14-16]表明佛手提取物有降血脂和降血糖作用、可調節胰島素敏感性、改善脂質和葡萄糖代謝，但對其干預T2DM 的靶點機制缺乏整體系統研究。

近年來，基于網絡藥理學方法的中醫藥治療T2DM 相關研究層出不窮，李梢[17，18]最早提出生物網絡與中藥方劑研究，為中醫網絡藥理學方法論及中醫藥現代化研究奠定基礎。網絡藥理學具有整體性和多向性，通過分子網絡信息挖掘、數據篩選和網絡構建等方式，系統闡述藥物的藥理作用及機制。本文與中醫藥治療T2DM 研究[19，20]運用數據挖掘方法類似、治療靶點也多有一致性[21]，說明運用網絡藥理學研究中醫藥療效方法可靠、結果準確，可為進一步研究提供思路。基于此，本研究擬應用網絡藥理學，預測佛手干預T2DM 的潛在作用靶點及藥物作用機制，為開發針對性藥物及臨床應用提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 疾病靶點預測

通過藥物作用靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD，https://db.idrblab.org/ttd/）、Drugbank 數據 庫（https://www.drugbank.ca/）、OMIM（http://www.omim.org/）和 DisGeNET 數據庫（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）檢索 T2DM 英文名，得到T2DM 相關基因，并將靶點基因導入Uniport 數據庫（http://www.uniprot.org/）進行基因標準化，刪除重復及無法標準化靶點基因后整合匯總，作為疾病的候選靶點基因。

1.2 藥效成分虛擬篩選

基于藥代動力學參數吸收、分布、代謝、排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME），在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以“佛手”為關鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.14為條件進行檢索，將得到的化學成分，作為佛手的候選藥效成分。

1.3 藥效成分靶點預測

將篩選出的候選藥效成分導入PubChem 數據庫（https://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov/）查 詢 各 成 分 的SMILE結構，或通過ALOGPS 2.1（http://www.vcclab.org/lab/alogps/）計算其SMILE結構，將SMILE結構導入Swiss Target Prediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）預測候選藥效成分的作用靶點，并將得到的作用靶點導入Uniport數據庫進行基因標準化。

1.4 網絡構建和分析

基于疾病靶點預測、佛手藥效成分篩選和成分靶點預測，得到疾病靶點關系及藥效成分-靶點關系，導入該數據并通過Cytoscape 3.7.1 軟件功能設置，構建出3 個網絡，分別是：疾病-靶點關系網絡，藥效成分-靶點關系網絡，疾病-藥效成分-靶點關系網絡。再利用軟件中的“NetworkAnalyzer”功能對自由度（degree）等網絡拓撲參數進行統計分析。將預測出佛手干預T2DM 的靶點導入 STRING 數據庫（https://string-db.org/），得到佛手干預T2DM的靶點相互作用關系。

1.5 藥效成分-靶點分子對接

從 RSCB PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載靶蛋白的3D 結構pdb 格式文件，運用Auto Dock 軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子），保存為pdbqt 格式文件。從PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化合物 2D 結構的 mol2 格式文件，利用PyRx 軟件上傳化合物文件使其能量最小化，并將其轉化為pdbqt 格式文件，最后運用Vina 進行對接。一般認為配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生作用的可能性越大。結合能≤0 kJ·mol-1說明配體與受體可以自發結合，本研究以結合能≤-5.0 kJ·mol-1為篩選條件。

1.6 生物學功能和通路分析

將佛手和T2DM 共同靶點導入DAVID 6.8 數據庫（https://david. ncifcrf. gov/），物 種 選 擇 人 類（homo sapiens，human），進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。利用imageGP 工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）繪制“佛手干預T2DM的生物學過程分析”圖、“佛手干預T2DM的分子功能分析”圖。

2 結果

2.1 疾病靶點預測結果

分別利用 TTD（56 個）、Drugbank（157 個）、OMIM（73 個）和 DisGeNET（2 個）等 4 個數據庫進行檢索T2DM，共得到181 個相關基因，作為疾病候選靶點基因（圖1）。

2.2 藥效成分虛擬篩選結果

通過篩選，共得到7 種候選藥效成分，包括固醇類、黃酮類及油酸等（表1）。

2.3 藥效成分靶點預測結果

通過PubChem 數據庫進行查詢，或將其二維結構導入ALOGPS 2.1計算得到各成分的SMILE結構，通過Swiss Target Prediction 數據庫預測出成分的作用靶點，并導入Uniport數據庫進行基因標準化。共得到成分-靶點關系65對。

2.4 網絡構建與分析結果

2.4.1 疾病靶點關系網絡構建

在STRING數據庫導入T2DM相關靶點基因，通過其功能插件獲得靶點基因關系，再利用Cytoscape 3.7.1軟件，構建疾病靶點關系網絡（圖2）。網絡顯示：181個節點，2915條邊，分析網絡平均鄰節點數結果為32.210。

2.4.2 藥效成分-靶點關系網絡構建

在Cytoscape 3.7.1 軟件中導入篩選出的藥效成分-靶點關系，構建藥效成分-靶點關系網絡。網絡顯示：72 個節點（7 個藥效成分節點、65 個成分相關靶點基因節點），65 條邊，分析網絡平均鄰節點數結果為1.806。

2.4.3 疾病-藥效成分-靶點-通路關系網絡

（1）佛手干預T2DM 的靶點及靶點間相互作用關系

Cytoscape 3.7.1軟件中的“Merge”功能可合并分析網絡，利用該功能將疾病靶點關系網絡與藥效成分-靶點關系網絡合并，得到佛手干預T2DM 的預測靶點，將該結果導入COXPRESdb 數據庫（https://coxpresdb.jp/）進行基因共表達的網絡拓展，通過STRING 構建預測靶點相互作用關系圖（圖3），以Score ≥0.9 為條件，共篩選出25 個基因（表2），作為佛手干預T2DM 預測靶點的最終結果。

（2）疾病-藥效成分-靶點-信號通路關系網絡構建

在Cytoscape 3.7.1 軟件中導入疾病-藥效成分-靶點關系，得到疾病-藥效成分-靶點關系網絡。

圖1 疾病靶點維恩圖

表1 佛手候選藥效成分篩選結果表

將25 個關鍵靶點導入DAVID 6.8 數據庫，物種選擇Homo sapiens（Human），得到10 條KEGG 通路，包括3 條信號通路（PPAR 通路、NOD 樣受體通路、TNF 通路）。在Cytoscape 3.7.1 軟件中導入靶點-通路關系，得到靶點-通路關系網絡。

基于疾病-藥效成分-靶點關系網絡與靶點-通路關系網絡，利用“Merge”功能合并網絡，最終得到疾病-藥效成分-靶點-通路PPI 網絡（圖4）。網絡顯示：42 個節點（1 個佛手節點、6 個佛手藥效成分節點、25個T2DM 疾病靶點節點、10 個通路節點），91 條邊，分析網絡平均鄰節點數結果為4.333。

2.4.4 藥效成分-靶點分子對接

選取10 個（S1-S10）關鍵蛋白與6 個佛手藥效成分，利用Vina進行分子對接。以結合能≤-5.0 kJ·mol-1為篩選條件，結果（表3）顯示，蛋白SQLE、CYP51A1、IDI1、PTPN1、CXCL8 與化合物 Sitosterol alpha1 結合能最低，分別為-7.2 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1、-7.0 kJ·mol-1、-8.1 kJ·mol-1、-9.3 kJ·mol-1，而蛋白HMGCR、HMGCS1、MSMO1、NCOA3、PTGS2 則與化合物5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone 結合能最低，分別為-7.5 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1、-8.5 kJ·mol-1、-8.1 kJ·mol-1、-9.0 kJ·mol-1。由分子對接結果可見，佛手的6種有效化學成分與T2DM關鍵蛋白形成構象能量低、結構穩定、結合活性較高。

圖3 佛手和T2DM共同靶點間相互作用關系圖

表2 佛手干預T2DM的靶點預測結果

圖4 疾病-藥效成分-靶點-通路關系網絡

表3 藥效成分-靶點分子對接結果

2.4.5 結合模式分析

根據“2.4.4”項分子對接結果，對表3 中結合最低（潛在活性最高）的PTGS2（PDB ID：5IKR）與5,2',6'-Trihydroxy-7, 8-dimethoxyflavone、CXCL8（PDB ID：4XDX）與Sitosterol alpha1 的分子對接模型進行分析（圖5）。3D 結合模式顯示，5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone結合于蛋白PTGS2的α螺旋結構域和β折疊結構域交界處的柔性loop 區靠近N 端區域，Sitosterol alpha1則結合于蛋白CXCL8的柔性loop區中心區域。

2D 結合模式顯示，5, 2', 6'-Trihydroxy-7, 8-dimethoxyflavone 與蛋白PTGS2 結合時，配體羥基可與His39B、Tyr130B、Ayg44B、Cys47B形成氫鍵作用（圖中虛線為氫鍵），在Pro153B、Cys36B、Leu152B 處有疏水作用力和范德華力。Sitosterol alpha1 與蛋白CXCL8結合時，配體羥基可與Lys3A 形成氫鍵作用，在Arg26A處有疏水作用力和范德華力。

2.5 生物學功能和通路分析結果

2.5.1 生物學功能分析

（1）GO分析結果

圖5 PTGS2與5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone和CXCL8與Sitosterol alpha1的對接模式

圖6 佛手干預T2DM的生物學過程分析（P ≤0.05）

圖7 佛手干預T2DM的分子功能分析（P ≤0.05）

將佛手和T2DM 靶點的25 個共同靶點導入DAVID 6.8數據庫，物種選擇為Homo sapiens（Human），篩選條件為P≤ 0.05，進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，共確定了57 個GO 條目。其中有43 條關于生物過程的條目，主要有膽固醇生物合成過程、對脂多糖的反應、類異戊二烯生物合成過程、葡萄糖穩態調節、RNA 聚合酶II 啟動子的轉錄起始、血壓負調節、胰島素分泌的正調節、脂質代謝過程、甘油三酯吸收負調節、膽固醇貯存負調節、脂多糖的細胞反應及脂肪酸轉運等方面；10 條關于分子功能的條目，包括藥物結合、脂質結合、蛋白磷酸酶2A結合、脂肪酸結合、NADP結合、類固醇激素受體活性及趨化因子活性等方面。

（2）GO分析結果繪圖

用 imageGP 工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）繪制“佛手干預T2DM涉及的生物學過程分析”（圖6）、“佛手干預T2DM涉及的分子功能分析”（圖7）。

2.5.2 KEGG分析

將佛手和T2DM 靶點的25 個共同靶點導入DAVID 6.8 數據庫，物種選擇 Homo sapiens（Human），得到10條KEGG通路。顯示佛手干預T2DM可能是參與了 PPAR 信號通路、TNF 信號通路的調控、NOD 樣受體信號通路、類固醇生物合成及代謝通路等過程，利用imageGP工具繪制“佛手干預T2DM通路”（圖8）。

圖8 佛手干預T2DM通路（P ≤0.05）

3 討論

T2DM 的發病機制尚不明確，目前大多考慮與胰島素抵抗[1]、炎癥細胞因子[3]、及DNA 甲基化[22]等方面相關。現有的治療藥物多是通過改善肝腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路[23]、調節胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）生成[24]、抑制鈉-葡萄糖協同轉運蛋白 2（SGLT-2）表達[25]及改善胰島β細胞分泌功能[26]等方面治療T2DM。

本研究發現，佛手可通過谷甾醇α甾醇、黃酮類（甲氧基黃酮）、角鯊烯等6 個有效成分干預T2DM 的25 個靶點基因和10 條相關通路發揮作用，其中的靶點基因主要有MSMO1、PTPN1、NCOA3、PTGS2、NOS2、FABP4、RBP4、FFAR1、CXCL 家族及 PPAR 家族等，上述基因功能主要與調節胰島素信號通路、體內炎癥狀態、胰島素分泌、脂質代謝等密切相關。其中MSMO1 基因的位點既與調節體內血糖水平相關[27]，又與高密度脂蛋白膽固醇相關[28]；PTPN1 基因參與胰島素信號通路的傳導調控[29]，且中國女性人群中，PTPN1 啟動子甲基化升高是T2DM 的危險因素[30]；NCOA3 基因（即SRC-3）通過減少PGC-1 的乙酰化作用防止肥胖并提高胰島素敏感性[31]；PTGS2（COX-2）與胰島素分泌有關[32]；NOS2 可促進 COX2（PTGS2）的激活[33]，也可作用于NO 生成，導致內皮功能障礙，最終影響T2DM；FABP4 也稱為A-FABP，可調節胰島素敏感性，并參與炎癥與胰島素信號傳導[34]；IRS1-Ras-MAPK 通路是胰島素受體的信號傳導通路，RBP4 可通過調節該通路，影響T2DM 的胰島素抵抗[35]；通過干預胰島β細胞，FFAR1 可調節胰島素分泌[36]；CXCL家族與糖尿病和高脂血癥發生發展相關[37]。在糖尿病發病中，PPAR 信號通路是重要調節通路之一，PPARs 是核轉錄因子超家族成員，通過配體激活的方式在T2DM 及肥胖病程進展中起重要作用，被認為是代謝綜合征治療中最有前景的靶標之一[38]。PPAR 家族與糖脂代謝及胰島素抵抗密切相關[39，40]。說明佛手干預T2DM 是通過多成分、多靶點、多通路共同作用的結果。

此外，研究中還發現，佛手的有效成分可以同時作用于HMGCR、HMGCS1、CYP51A1、IDI1 及 SQLE 等靶點參與膽固醇生物合成、脂質合成和脂蛋白代謝等過程[41-45]，說明佛手具有潛在的調脂作用，這些靶點則是佛手發揮調脂作用的潛在靶點。

基于此，兼具疏肝理氣與燥濕化痰功效的佛手，可以同時作用于具有調節糖、脂代謝的靶點和通路，為其臨床應用于糖脂代謝紊亂合并或并病的患者提供了依據，同時說明中藥治療慢性、代謝性、復雜性疾病具有極大的研究潛力和價值。