四溴雙酚A和四氯雙酚A對非洲爪蛙蝌蚪的毒性效應

牛玥，朱敏，劉芃巖，秦占芬,*

1. 中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085 2. 河北大學化學與環境科學學院，保定 071002 3. 中國科學院大學，北京 100049

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)和四氯雙酚A (tetrachlorobisphenol A, TCBPA)作為阻燃劑在塑料、合成纖維等材料中廣泛應用[1-3]。目前，TBBPA和TCBPA在多種環境介質、生物樣品乃至人體樣品中均有較高的檢出率[4-9]。Liu等[10]分析了關于我國普通水體中TBBPA濃度的報道，認為平均濃度<10 ng·L-1。但在TBBPA污染嚴重的巢湖水體中，Yang等[11]檢測到TBBPA濃度為850～4 870 ng·L-1。Wang等[12]的研究結果顯示，TBBPA在污水中濃度最高可達19.3 μg·L-1。近幾年，飲用水中TBBPA和TCBPA也被檢出[13]。因此，TBBPA和TCBPA的安全性受到越來越多的關注。

資料顯示，TBBPA與TCBPA對水生生物的毒性為中毒或極毒，遠高于哺乳動物[14-17]。兩棲動物是生物體由水生到陸生的過渡類型，被認為是生態環境監測的重要指示類群。目前，關于TBBPA和TCBPA對兩棲動物毒性的數據還相對較少，未見相關急性毒性的報道。另外，化學品暴露一般會引起谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)、谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase, GST)、硫氧還原蛋白(thioredoxin, TRX)和過氧化氫酶(catalase, CAT)等幾個氧化應激標記在轉錄水平或者酶活性的變化。曾有研究報道，低濃度的TBBPA影響斑馬魚體內CAT和GPX酶的活性及活性氧(ROS)的濃度[18-19]。鞏文靜等[17]報道，亞致死濃度下TBBPA導致太平洋真寬水蚤體內產生氧化應激。另外，熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)也是與氧化應激相關的參數，一些化學品也可影響HSP27、HSP70和HSP90等幾個熱激活蛋白的水平[20]。Hu等[18]報道高濃度的TBBPA影響斑馬魚體內hsp70基因的表達。

本文選擇生態毒理學中常用的兩棲類模式種非洲爪蛙，研究了TBBPA和TCBPA的急性毒性以及對氧化應激標記物的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗動物

本實驗室飼養的非洲爪蛙成年雌蛙和雄蛙，分養于盛有去氯自來水的玻璃缸中，每個玻璃缸大約10只成蛙，水溫21～22 ℃，明暗光周期為12 h∶12 h。成蛙喂食豬肝和商品飼料，每周各1次，喂食2 h后換水。

非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU促黃體素釋放激素(LHRH)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，雄蛙注射200～300 IU。將雌雄蛙放于產卵容器中，置于黑暗、安靜的環境中讓其抱對，12 h左右即可產卵。受精卵在21～22 °C的去氯自來水中孵化，胚胎發育至48期的蝌蚪，進行暴露試驗。

1.2 試劑與儀器

儀器和設備：高速冰凍離心機(Centrifuge 5430，Eppendorf，德國)；PCR儀(9700，Applied Biosystem，美國)；熒光定量PCR儀(MX3500P，Strata gene，美國)；組織碾磨儀(MM301，Retsch，德國)；渦旋混勻器(Vortex3000，Wiggens，美國)；全自動核酸提取儀(AU1001，北京百泰克生物技術有限公司，中國)；電子天平(JA2003B，上海越平科技儀器有限公司，中國)；移液器(Eppendorf，德國)；全自動凝膠成像儀(GBOX-HR，Syn Gene，英國)；普通PCR儀(My Cycler TM，Bio-Rad，美國)；電泳儀(DYCP-31F，北京六一儀器廠，中國)。

試劑：TBBPA(純度97%，Acros公司，比利時；分子量543.88，CAS No.79-94-7)；TCBPA(純度98%，梯希愛化成工業發展有限公司，中國上海；分子量336.06，CAS No.79-95-8)；二甲基亞砜(DMSO)(純度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司，美國；CAS No. 67-68-5)；核酸染料(G-red)和RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司，中國)；反轉錄試劑盒Fast Quant RT Kit和RT-qPCR試劑盒Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)kit(天根生化科技有限公司，中國北京)；PCR引物(華大基因，中國北京)。

1.3 蝌蚪急性毒性試驗

TBBPA和TCBPA用助溶劑DMSO配成100 g·L-1的儲備液。設置溶劑對照組，其中，溶劑的濃度與處理組溶劑濃度相同，溶劑的體積濃度不超過0.01%。暴露試驗在玻璃缸里面進行，每個缸盛有1 L試驗液，蝌蚪隨機放入10尾。每隔24 h換一次水，清除死亡個體，記錄死亡數，試驗持續48 h。

在正式試驗之前先對2種化學物質進行較大濃度范圍(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的預試驗，不設平行組，各濃度的缸中加入10尾蝌蚪，觀察記錄48 h蝌蚪死亡數。根據預試驗得出的結果，設置正式試驗濃度。正式試驗以1.4為公比設置了7個濃度梯度(表1)和溶劑對照組，每組3個平行，每個缸中隨機加入10尾蝌蚪；其他同預試驗；重復2次正式試驗。

表1 正式暴露實驗中四溴雙酚A(TBBPA)和四氯雙酚A(TCBPA)的濃度Table 1 Concentrations of tetrabromobisphenol A (TBBPA) and tetrachlorobisphenol A (TCBPA) in exposure experiments

1.4 RNA提取和RT-qPCR實驗

每個缸隨機取2尾蝌蚪，用全自動核酸提取儀提取RNA，超微量分光光度計(51119500C，Thermo Fisher Scientific，美國)測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳來確定RNA完整性。然后根據Fast Quant RT Kit(with g DNase)說明書配制20 μL反應體系進行反轉錄。

根據SYBR Green PCR Kit說明，配制10 μL反應體系進行RT-qPCR實驗。PCR程序為：95 ℃預變性15 min，40個循環擴增(95 ℃變性10 s、退火20 s、72 ℃延伸20 s)。每個基因在使用之前都進行了擴增效率的驗證，計算公式為E=(10-1/slope-1)×100。擴增效率在90%～110%之間，溶解曲線單一且重合，不存在非特異性擴增的基因才可用于后續實驗。進行基因表達分析時，以rpl8為管家基因對各個基因的表達進行標準化[21]。基因的相對表達量根據公式2-ΔΔCT計算[22]。引物及相關信息如表2所示。

表2 RT-qPCR引物及相關信息Table 2 Primers sequences and relevant information on RT-qPCR

1.5 數據統計與分析

用SPSS 16.0進行數據分析。統計單元為缸，即n值等于平行缸數[21]。重復2次正式試驗，得到相似的結果，在文中只呈現其中一次的試驗數據[23]。回歸分析使用Probit模型，建立“劑量-效應”線性方程，并計算半數致死濃度(LC50)值及其95%置信區間。統計數據均以平均值±標準誤(standard error of mean, SEM)表示。暴露組中以各自的參照相比的顯著性差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，P值<0.05認為有顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 TBBPA與TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性

溶劑對照組無死亡，表明試驗質量控制良好。TBBPA和TCBPA暴露組蝌蚪的死亡率變化如圖1所示。24 h時，6.00mg·L-1TBBPA和8.00 mg·L-1TCBPA暴露組的蝌蚪存活率均為0。3.06 mg·L-1和4.28 mg·L-1的TBBPA暴露組蝌蚪的存活率分別為97%和53%，4.08 mg·L-1和5.71 mg·L-1的TCBPA暴露組蝌蚪的存活率分別為27%和10%，其他濃度暴露組的蝌蚪均無死亡現象發生。48 h時，全部暴露組蝌蚪的存活率均未發生改變。觀察蝌蚪死亡現象時發現，6 mg·L-1TBBPA暴露組加入TBBPA后，蝌蚪沉到水底，不再游動，24 h后全部死亡，8 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪的死亡現象同6 mg·L-1TBBPA暴露組。4.28 mg·L-1TBBPA與5.71 mg·L-1TCBPA暴露組存活蝌蚪的心臟與尾部周圍觀察到明顯的凝血現象，TBBPA和TCBPA的濃度分別低于3.06 mg·L-1和2.92 mg·L-1時不再發生凝血現象。

圖1 TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪存活率的影響Fig. 1 Effects of TBBPA and TCBPA on survival rates of Xenopus laevis tadpoles

經統計分析得到TBBPA和TCBPA對蝌蚪的24 h-LC50分別為4.31 mg·L-1和3.99 mg·L-1，48 h-LC50與24 h-LC50相同(表3)。TBBPA與TCBPA的毒性相當。

表3 TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪的半數效應濃度(LC50)及其95%置信區間和回歸方程Table 3 The median lethal concentration (LC50), 95% confidence interval and regression equations of TBBPA and TCBPA to Xenopus laevis tadpoles

2.2 TBBPA與TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪體內氧化應激相關基因轉錄的影響

RT-qPCR結果表明，暴露48 h后，0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA顯著上調蝌蚪體內gst和trx這2種基因的轉錄水平，呈線性劑量-效應關系(圖2)。3.06 mg·L-1TBBPA暴露組與2.92 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪體內gr基因的轉錄水平被顯著促進。0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA蝌蚪體內cat和gpx基因的轉錄水平呈倒“U”型趨勢，0.79 mg·L-1和1.12 mg·L-1TBBPA暴露組和1.06 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪體內的cat和gpx基因的相對表達量被顯著上調。

圖2 TBBPA(a)和TCBPA(b)對非洲爪蛙體內氧化應激標記基因轉錄的影響注：*P<0.05，與對照組相比。Fig. 2 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on oxidative stress marker genes in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

2.3 TBBPA與TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪體內熱休克蛋白轉錄的影響

RT-qPCR結果表明，暴露48 h后，0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA對蝌蚪體內的hsp27基因的轉錄水平無顯著性影響(圖3)。TBBPA及TCBPA暴露組蝌蚪體內hsp70和hsp90基因的轉錄水平與TBBPA及TCBPA暴露濃度呈“倒U型”關系，且TBBPA濃度為1.12 mg·L-1時，蝌蚪體內hsp70和hsp90的轉錄水平被顯著上調；當TCBPA濃度為1.06 mg·L-1時，蝌蚪體內hsp90的轉錄水平被顯著上調。

圖3 TBBPA(a)和TCBPA(b)對非洲爪蛙體內熱休克蛋白轉錄的影響注：*P<0.05，與對照組相比。Fig. 3 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on heat shock protein genes in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

2.4 TBBPA與TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪體內凝血基因轉錄的影響

TBBPA和TCBPA暴露組蝌蚪心臟與尾部出現凝血現象(圖4)。因凝血現象的出現，選擇f2、f10和serpina基因作為指標，探究TBBPA與TCBPA對蝌蚪體內凝血基因轉錄水平的影響。研究發現，暴露于TBBPA和TCBPA 48 h后，凝血基因f2、f10和serpina的表達有一定的變化趨勢(圖5)：0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA促進蝌蚪體內凝血基因f2、f10和serpina的轉錄水平，呈線性劑量-效應關系，并在3.06 mg·L-1表現出顯著性差異；TCBPA暴露組蝌蚪體內f2、f10和serpina基因的轉錄水平與TCBPA濃度(1.06～2.92 mg·L-1)呈“倒U型”關系，1.06 mg·L-1和1.49 mg·L-1的TCBPA顯著促進蝌蚪體內f2基因的轉錄水平，1.49 mg·L-1的TCBPA顯著促進蝌蚪體內f10和serpina的轉錄水平。

圖4 TBBPA和TCBPA暴露48 h導致的非洲爪蛙蝌蚪心臟和尾部凝血現象注：(a)和(d)為對照；(b)和(e)為TBBPA暴露組；(c)和(f)為TCBPA暴露組。Fig. 4 Coagulation phenomenon in hearts and tails of Xenopus laevis tadpoles following 48 h-exposure to TBBPA and TCBPANote: (a) and (d) are control group; (b) and (e) are TBBPA group; (c) and (f) are TCBPA group.

圖5 TBBPA(a)和TCBPA(b)對非洲爪蛙體內凝血因子轉錄的影響注：*P<0.05，與對照組相比。Fig. 5 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on coagulation gene in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

3 討論(Discussion)

本研究結果表明，TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪的48 h-LC50分別為4.31 mg·L-1和3.99 mg·L-1。根據國家關于危險化學品魚類急性毒性分類準則，TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙的毒性均為中等毒性[24]。Song等[25]的研究表明，TBBPA和TCBPA對斑馬魚的LC50分別為0.75 mg·L-1和1.24 mg·L-1，毒性分別為高毒和中毒；Hallgren等[15]報道了TBBPA對大鼠的半數致死劑量(LD50)為10 g·kg-1，毒性為微毒。總體來看，TBBPA對非洲爪蛙的毒性與水生生物斑馬魚類似，而遠高于對哺乳動物的毒性。另外，研究發現TBBPA和TCBPA均導致蝌蚪心臟和尾部產生凝血現象，其作用機制還有待于進一步研究。

TBBPA和TCBPA顯著上調非洲爪蛙體內氧化應激相關基因gst和trx的轉錄水平，呈線性劑量-效應關系，TBBPA和TCBPA對蝌蚪體內gr基因轉錄水平的影響呈“升高-平臺期-升高”的趨勢，并在TBBPA與TCBPA的最高濃度暴露組表現出顯著性差異。gst、trx和gr基因的轉錄水平與氧化應激效應呈正相關。對比TBBPA與TCBPA相似濃度暴露組(如1.12 mg·L-1TBBPA暴露組與1.06 mg·L-1TCBPA暴露組)蝌蚪體內gst、trx和gr的轉錄水平后發現，TBBPA暴露組蝌蚪體內gst、trx和gr基因的相對表達量均與TCBPA暴露組類似。TCBPA暴露組蝌蚪體內cat和gpx基因相對表達量的變化趨勢與TBBPA相同，呈先升高后降低的倒“U”型趨勢。綜上所述，TBBPA和TCBPA誘導非洲爪蛙蝌蚪產生氧化應激效應，二者效應相當。結合本實驗室之前關于雙酚A替代品與雙酚A對非洲爪蛙毒性的研究，發現無論是BPA及BPA替代品(BPF和BPAF)還是BPA的衍生物(TBBPA和TCBPA)對非洲爪蛙幾個經典氧化應激標記基因的轉錄水平的影響都十分顯著，尤其對gst基因的影響，均呈良好的線性劑量-效應關系。

TBBPA與TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪體內熱休克蛋白表達的影響表明，TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙體內hsp27基因的轉錄水平無顯著性影響，1.12 mg·L-1TBBPA暴露組蝌蚪體內的hsp70與hsp90轉錄水平被顯著上調，1.06 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪體內hsp90的轉錄水平被顯著上調，TBBPA和TCBPA對蝌蚪體內hsp70和hsp90的轉錄水平的影響整體均呈先升高后降低的“倒U型”。總體來看，TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙體內熱休克蛋白的影響不大，只有個別濃度會引起hsp70和hsp90基因的微弱表達。結合本實驗室之前關于雙酚A替代品與雙酚A對非洲爪蛙毒性的研究，發現BPA、BPA替代品和BPA的衍生物對熱休克蛋白相關基因轉錄水平的影響均不顯著。

綜上所述，TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪的毒性相近均為中毒，與對水生生物斑馬魚的毒性類似，遠高于對哺乳動物的毒性；TBBPA和TCBPA對非洲爪蛙蝌蚪的氧化應激效應也接近，但不引起熱休克蛋白轉錄的變化。