Al^3＋和Cr^6＋對(duì)菊芋多酚氧化酶同工酶的酶活影響

黎軍

【摘 要】本文論述采用聚丙烯酰胺電泳法（PAGE），以 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四種濃度不同的凝膠系統(tǒng)分離經(jīng) Al3+ 和 Cr6+ 處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，用兩種染色配方進(jìn)行染色比較，并進(jìn)行酶譜分析，得到的結(jié)果表明：（1）在 T=10% 凝膠系統(tǒng)中菊芋 PPO 同工酶分離效果最好，共有10條酶帶;（2）在兩種染色液配方中，配方一的染色效果較好;（3）經(jīng) Al3+ 處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活比沒有處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活性低，說明 Al3+ 對(duì)菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性有抑制作用;（4）經(jīng) Cr6+ 處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活與沒有處理過的菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的酶活相差不大，說明 Cr6+ 對(duì)菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶的活性抑制不明顯。

【關(guān)鍵詞】菊芋 聚丙烯酰胺電泳法 多酚氧化酶同工酶? Al3+ Cr6+

【中圖分類號(hào)】G? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】0450-9889（2020）38-0039-03

菊芋，別名鬼子姜、洋姜，菊科（compositae）向日葵屬植物，能形成地下塊莖的多年生草本植物，學(xué)名heianthustuberosusl，染色體數(shù) 2N=102，六倍體物種。原產(chǎn)北美洲，經(jīng)歐洲傳入我國。現(xiàn)我國大多數(shù)地區(qū)都栽培種植，是一種抗旱、抗風(fēng)沙、耐寒、無病蟲害、抗逆性強(qiáng)并具有廣泛適應(yīng)性的物種，植株高 1—3 米，根系發(fā)達(dá)，具有再生性強(qiáng)等特點(diǎn)。據(jù)相關(guān)資料報(bào)道，菊芋可用于治理沙漠但未廣泛應(yīng)用。菊芋能成為沙漠之星與它的生長特性有關(guān)，而它的生長特性與菊芋植物體內(nèi)的酶系統(tǒng)有關(guān)。目前未見有太多關(guān)于菊芋多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，簡稱 PPO）同工酶研究資料的報(bào)道。本文運(yùn)用聚丙烯酰胺電泳及活性染色方法，對(duì)菊芋中的多酚氧化酶（PPO）同工酶酶譜進(jìn)行分析，為尋找與菊芋特殊生命力有關(guān)的酶提供基礎(chǔ)資料，并為菊芋能作為治理干旱地區(qū)的植物之一提供一些生理化指標(biāo)。

一、材料與試劑

（一）材料

實(shí)驗(yàn)材料：菊芋。

菊芋的預(yù)處理：種植 14 盆菊芋幼苗，每 2 盆作為 1 個(gè)編號(hào)，分別編號(hào) 1，2，3，4，5，6，7。其中，1 號(hào)為對(duì)照，只澆清水，不用作其他任何處理。用 Al2（SO4）3 分別配成濃度為 50 umol/L，100 umol/L，200 umol/L 的溶液各適量，分別澆在 2，3，4 號(hào)植株中，每次各 50 ml，每隔 3 天澆一次，共要澆 4 次。用 K2Cr2O7 分別配成濃度為 50umol/L，100umol/L，200 umol/L 的溶液各適量，分別澆在 5，6，7 號(hào)植株中，每次各 50 ml，每隔 3 天澆一次，共要澆 4 次。

（二）藥品

丙烯酰胺（Acr，廣州醫(yī)藥站化學(xué)試劑公司），N N 一甲雙叉丙烯酰胺（Bis，F(xiàn)luka），過硫酸胺（Ag，廣東汕頭新寧華工廠），三羥基甲基氨基甲烷（Tris，成都化學(xué)試劑廠），氨基乙酸（Gly，廣東汕頭新寧華工廠），四甲基乙二胺（TEMED，東京化成工業(yè)株式會(huì)社），分析純鹽酸。

染色藥品：鄰苯二胺（O—phen，上海試劑總廠第三分廠），對(duì)苯二胺（P—phen，上海五聯(lián)化工廠），鄰苯二酚（Pyro，上海試劑總廠第三分廠），草酸（Dxal，廣東汕頭西隴化工廠），蔗糖（Sucr，廣州化學(xué)試劑廠），磷酸氫二鈉（Diso，廣東汕頭西隴化工廠），磷酸二氫鈉（上海新華化工廠）。

（三）儀器

離心機(jī)（TGL—16 型，上海醫(yī)療機(jī)器六廠），電泳儀（702B型上海市醫(yī)藥公司）。

二、方法

（一）酶液的提取

稱取菊芋成熟葉子 200mg，置于預(yù)冷的小研缽中，加 0.05mol/L Tris-HCL（PH=8.0）提取緩沖液 1 ml，在冰浴中研磨成勻漿，然后冷凍離心（12000/min）20 min，棄沉淀，收集上清液為粗酶液并滴加 10% 蔗糖溶液 2 滴保存于冰箱中備用。

（二）凝膠的制備

制備聚丙烯酰胺凝膠。凝膠配制系統(tǒng)，如表 1 所示（見下頁）。

（三）加樣

用微量進(jìn)樣器上樣。菊芋 PPO 同工酶用 T=10% 膠濃度進(jìn)行電泳，每管上樣量為 60ul。電泳上樣前在酶液中加入 1 滴 0.1% 溴酚藍(lán)，混勻后上樣。

（四）電泳

開始電泳時(shí)采用穩(wěn)壓 49V，25 分鐘后，電壓加大為 149V，電泳在常溫下進(jìn)行，時(shí)間約需 2.5 小時(shí)。

（五）染色

當(dāng)樣品從（-）電泳到距（+）還有大概 1 厘米的時(shí)候，用注射器吸取蒸餾水注射到玻璃管中使凝膠從玻璃管中滑出，分別放到干凈試管中，然后現(xiàn)配染色液。配染色液采用的染色配方有兩種：

配方一：按 0.06% 對(duì)苯二胺（用適量 0.01M 草酸溶解后再加蒸餾水混合）∶1% 鄰苯二酚∶0.05M 磷酸緩沖液（PH=6.8）=1∶6∶1（V/V）配制，將配好的染色液加入各個(gè)試管中（染色液要浸過凝膠），待染色 15—20 分鐘后觀察酶帶的出現(xiàn)情況，待酶帶較為清晰的時(shí)候倒去染色液，加 2% 的醋酸浸泡，保存，拍照。

配方二：按 0.06% 鄰苯二胺（用適量 0.01M 草酸溶解后再加蒸餡水混合）：1% 鄰苯二酚：0.05M 磷酸緩沖液（PH=6.8）=1∶6∶1（V/V）配制，將配好的染色液加入各個(gè)試管中（染色液要浸過凝膠），待染色 15—20 分鐘后觀察酶帶的出現(xiàn)情況，待酶帶較為清晰的時(shí)候倒去染色液，加 2% 的醋酸浸泡，保存，拍照。

（六）Al3+，Cr6+ 對(duì)菊芋處理后的菊芋 PPO 同工酶酶活性的測定

方法：以 50 m mol/L 的鄰苯二酚（磷酸緩沖液，pH=6.5）為底物，加入適量的酶液，作用 5 分鐘后測產(chǎn)物在 420 nm處的吸光度，直接用吸光度表示酶活大小。

步驟：3 ml 酶液+5ul 顯色劑（鄰苯二酚），5 分鐘后測得A420 的值。

三、結(jié)果與分析

（一）菊芋 PPO 在不同凝膠濃度中和在不同染色配方中的電泳圖譜

1.菊芋 PPO 同工酶酶譜如圖 1 所示，在 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四種不同膠濃度中分別見到 9，10，8，7條 PPO 同工酶酶帶。在 T=15% 分離膠中僅見 7 條 PPO 同工酶酶帶，說明膠孔隙太小不能使分子量相近、形狀相似的同工酶分開。在 T=13% 中膠孔隙比在 T=15% 稍大，見到 8 條 PPO 同工酶酶帶，比 T=15% 膠多一條帶，在 T=7.5% 膠孔隙比在 T=13% 更大，見到 9 條 PPO 同工酶帶，比 T=15% 和 T=13% 分別多 2 條、1 條。而在 T=10% 中見到 PPO 同工酶酶帶有 10 條，可知在此濃度中 PPO 同工酶酶帶分辨率最高，分離效果最好。

2.在圖 1 中，Al，Bl，Cl，Dl 用的染色配方為染色配方一，染出帶數(shù)為 9，10，8，7。在 A2，B2，C2，D2 中，染色配方為染色配方二，染出帶數(shù)為 9，10，8，7。第二種染色配方相比于第一種染色配方，其染色酶帶清晰度低于第一種染色配方，可見第一種染色配方的染色效果較好。

（二）不同上樣量的菊芋 PPO 電泳圖譜

不同上樣量的菊芋 PPO 電泳圖譜如圖 2 所示，其中 A，B，C 上樣量分別為 50ul，60ul，70ul，經(jīng)染色后 A 有 9 條酶帶，B 和 C 各有 10 條酶帶，但其中 B 的酶帶比 C 中的酶帶較清晰，可知 60ul 的上樣量使酶帶分辨率更高，分離效果更好。

（三）Al3+，Cr6+ 對(duì)菊芋 PPO 同工酶酶活性的影響

由 Al3+，Cr6+ 對(duì)菊芋處理后的菊芋 PPO 同工酶酶活性的測定方法測得結(jié)果如表 2 所示（見下頁）。

由表 2 的數(shù)據(jù)可知，受處理過的 2，3，4 號(hào)的 PPO 同工酶的酶活受到 Al3+ 的影響酶活明顯下降;受處理過的 5，6，7 號(hào)的 PPO 同工酶的酶活受到 Cr6+ 的影響酶活變化不是很明顯。

（四）Al3+，Cr6+ 對(duì)菊芋中 PPO 同工酶電泳圖譜的影響

1.由圖 3 可以知道：（1）當(dāng)菊芋經(jīng) Al3+ 處理過后，它的電泳圖譜對(duì)照 1 號(hào)為 10 條酶帶;2，3，4 號(hào)的酶帶數(shù)分別為 9 條、8 條、7 條;2 號(hào)樣比 1 號(hào)樣少第 P7 條帶，3 號(hào)樣比 1 號(hào)樣少第 P4 和 P7 兩條帶，4 號(hào)樣比 1 號(hào)樣少第 P4、P6、P7 三條帶，帶數(shù)是呈遞減趨勢，酶帶顏色也逐漸變淺，酶帶粗度相對(duì)變小。原因可能是隨著 A13+ 的加入和濃度的增加，菊芋中的 PPO 及其同工酶的酶活性明顯降低，同時(shí)說明，Al3+ 對(duì)菊芋的生長影響較大。如果菊芋在生長環(huán)境中大量吸收 Al3+，那么 Al3+ 會(huì)抑制 PPO 及其同工酶的活性，極大降低菊芋的抗病性，不利于菊芋的生長。

2.菊芋經(jīng) Cr6+ 處理過后，它的電泳圖譜 5，6，7 號(hào)的酶帶數(shù)分別為 9，10，9;5 號(hào)樣比 1 號(hào)樣少第 P7 條帶，7 號(hào)樣比 1 號(hào)樣少第 P7 條帶，帶數(shù)變化不大，酶帶顏色變化不大，酶帶粗度相差也不大。這表明 Cr6+ 對(duì)菊芋的 PPO 及其同工酶的活性影響不是太明顯，但大量吸收也會(huì)破壞菊芋 PPO 及其同工酶的抗病性，不利菊芋的生長。

3.第 P7 條帶受 Al3+ 和 Cr6+ 的影響最大，其敏感性最強(qiáng)。其次為 P4 和 P6 兩條帶。

4.在七個(gè)樣品中，它們的 Pl、P2、P3 三條帶的顏色最深，說明它們的酶活力最大。

四、結(jié)論與討論

同工酶是指生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)，但分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶。同工酶（蛋白質(zhì)）在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率不同，能反映它們?cè)诜肿哟笮∩系牟町悺４蠖鄶?shù)基因性同工酶（由不同基因產(chǎn)生的肽鏈而衍生的同工酶）常表現(xiàn)不同的生理功能。同工酶既可以作為生理指標(biāo)，又可以作為可靠的遺傳指標(biāo)。我們可以根據(jù)同工酶譜的變化，來鑒別生物類別及其親緣關(guān)系。在生物學(xué)中，同工酶可用于研究組織分化、個(gè)體發(fā)育、遺傳變異、物種進(jìn)化、雜交育種等。

多酚氧化酶（PPO）是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱，是自然界分布極廣的一種金屬蛋白酶，也是一類氧化還原酶。普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中。目前科研人員已對(duì)多酚氧化酶與生物體抗病性之間的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究。植物中的多酚氧化酶能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對(duì)應(yīng)的醌類化合物，進(jìn)而發(fā)揮抗菌和驅(qū)趕捕食者的作用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是讓所分離的物質(zhì)帶上負(fù)電，然后根據(jù)所帶的負(fù)電荷數(shù)的不同、分子量大小的不同、分子形狀的不同，以及分子通過三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠時(shí)因遷移率的不同從而分離出同工酶。凝膠濃度的大小、pH 的大小、電極緩沖液離子強(qiáng)度的高低都會(huì)對(duì)分離結(jié)果造成一定的影響，使電泳結(jié)果產(chǎn)生或多或少的誤差。通過反復(fù)電泳實(shí)驗(yàn)探究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，需注意以下幾方面：（1）凝膠貯液使用前應(yīng)過濾 1～2 次，便于除去藥品中的雜質(zhì)。（2）凝膠貯液從冰箱中取出，應(yīng)過 20 分鐘以后再用，可以避免因熱脹冷縮而在凝膠柱中形成氣泡，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）電泳時(shí)間應(yīng)控制在 2～3 小時(shí)之間，時(shí)間過長，玻璃管發(fā)熱，酶帶擴(kuò)散，出現(xiàn)拖尾。（4）PPO 宜在 149V～200V 低壓電泳，電壓過高，電泳時(shí)間過短，不利于分子量相近的同工酶分離。

在 T=7.5%，T=10%，T=13%，T=15% 四種不同凝膠系統(tǒng)中，T=10% 的凝膠系統(tǒng)最適合菊芋中多酚氧化酶（PPO）同工酶的分離，其分離結(jié)果最清晰，效果最好。

在 T=10% 的凝膠系統(tǒng)中，上樣量為 60 ul 的分離效果最好，酶帶最為清晰。

在兩種染色配方中，配方一的染色效果比配方二清晰。

經(jīng)過 Al3+ 處理過的菊芋中的 PPO 同工酶活性明顯受到抑制，而經(jīng)過 Cr6+ 處理過的菊芋中的 PPO 同工酶活性影響不明顯。其中，第 P7 條帶受 Al3+ 和 Cr6+ 的影響最大，敏感性最強(qiáng)，其次為 P4 和 P6 兩條帶。在七個(gè)樣品中，它們的 P1，P2，P3 三條帶的顏色最深，說明它們的酶活力最大。

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（責(zé)編 盧建龍）