檸檬酸轉運體SLC25A1對食管鱗癌細胞體外放射敏感性的影響及其分子機制

師 盼，林重華，舒易方，瞿家權，宋淑亮*

(1.山東大學海洋學院，山東 威海 264209；2.陸軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科膽汁淤積肝病中心，重慶 400038；3.吉首大學醫學院醫學影像技術系，湖南 吉首 416000；4.陸軍軍醫大學第一附屬醫院腫瘤科放療中心，重慶400038)

食管癌是全球第七大常見癌癥，也是第六大癌癥死因，遺傳、煙草、酒精、熱飲、機械損傷、胃食管反流疾病、巴雷特食管、肥胖等因素是其高危因素[1]。與歐美國家比較，我國食管癌組織學類型[2]中食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的比例高，而食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)的比例低。放射治療(radiotherapy)[3]是不可手術的中晚期食管癌綜合治療的重要策略，然而即便采取包括根治性同步放化療、姑息性手術等綜合治療，局部晚期食管癌局控失敗率和遠處轉移率仍很高，5 年總的生存率約為20%，總體預后不良[4]。獲得性放療抵抗(radiotherapy resistance)[5]是指腫瘤初期對放療敏感但分割放療后短時間內發生復發和進展的臨床現象，也被認為是局部食管癌復發或治療失敗重要原因之一，并成為制約食管癌預后和療效改善的障礙。目前，大量研究提示[6]，乏氧、線粒體能量代謝狀態、線粒體膜通透性及電位改變、活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平和腫瘤干細胞特征與獲得性放射抵抗密切相關，但放射抵抗的確切機制仍不清楚。

線粒體溶質載體家族25A1(solute carrier family 25 member 1，SLC25A1)[7]又稱為檸檬酸轉運蛋白或三羧酸鹽轉運體，其缺失突變與人類疾病羥基戊二酸尿癥和肌無力綜合征相關。SLC25A1蛋白細胞亞定位于線粒體內膜[7]，其主要功能是檸檬酸鹽轉運的主要載體，參與線粒體氧化磷酸化及能量代謝。近年研究證實[8]，SLC25A1在多種腫瘤存在高表達，是p53突變體一個新的轉錄靶點，具有調控腫瘤細胞乏氧耐受，可作為腫瘤預后不良的生物標志物。因此，本研究采用TCGA 腫瘤組織數據庫比較食管腺癌、食管鱗癌與癌旁組織的SLC25A1 基因表達差異，通過構建放射抵抗和放射敏感食管鱗癌細胞系并證實放射抵抗食管鱗癌細胞存在SLC25A1 表達上調，采用體外放射模型評估SLC25A1 敲低對食管癌細胞系放射敏感性的影響，并初步探討SLC25A1 參與放射抵抗的分子機制，為篩選放射增敏靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人食管鱗癌細胞系KYSE150 由中南大學高等研究中心細胞保藏室購買，10%胎牛血清RPMI-1640 完全培養基，置于CO2體積分數為5%、37 ℃的細胞培養箱，常規胰酶消化，對數生長期細胞備用。放射抵抗的食管鱗癌細胞株[9]采用X 射線多次亞致死劑量暴露法建立。本研究采用的放射抵抗KYSE150-R 和對照組放射敏感KYSE150 細胞株均為多輪亞致死劑量的X射線照射后傳至第4～15代，并用體外放射克隆存活法鑒定。

1.1.2 試劑RPMI-1640 培養基為Gibco 公司產品；胎牛血清為以色列Biological Industries 生物有限公司產品；胰蛋白酶、NP-40 細胞裂解液、Hoechst33258熒光染料溶液、0.5%結晶紫染料、ROS染色流式檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；蛋白酶和磷酸化酶抑制劑為美國Roche 公司產品；轉染試劑Lipofectamin 2000 脂質體為美國Thermo Fisher 公司產品；β-actin和SLC25A1單克隆抗體以及抗兔和抗鼠二抗均為美國Proteintech 公司產品，Phospho-Histone H2A.X(Ser139) 位點磷酸化和Phospho-DNA-PKcs(Ser2056)位點磷酸化及Histone H2AX 和DNA-PKcs 單克隆抗體均為美國CST公司產品。

1.1.3 質粒及引物SLC25A1-shRNA 質粒購于山東維真生物公司，參考SCL25A1 的基因編號NM_005984；產品編號SH874543，提供4個不同干擾位點的shRNA質粒及對照組Scramble shRNA，載體名稱為pLent-U6-GFP，大小約1 000 bp，具有U6，CMV，eGFP 元件及嘌呤霉素抗性，質粒序列見表1。SLC25A1及GAPDH上下游引物見表2。

表1 SLC25A1 shRNA質粒及對照Scramble shRNA質粒序列

表2 SLC25A1和GAPDH基因上下游引物序列

1.1.4 儀器雙目倒置相差顯微鏡，產自日本奧林巴斯公司，CKX31 型；CO2細胞培養箱，產自美國賽默飛公司；雙目倒置熒光顯微鏡，產自德國萊卡公司，DM-IL 型；流式細胞儀，產自美國BD 公司，FACSVerse 型；醫用直線加速器，產自美國瓦里安公司，Clinac 2300 C/D 型，小型垂直電泳和轉膜系統，產自美國伯樂公司，Bio-Rad Mini-PROTEAN型。

1.2 方法

1.2.1 TCGA數據庫差異表達基因分析通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫官方網站(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)及由阿拉巴馬大學伯明翰分校UALCAN 交互式網絡工具(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)[10]分析TCGA 腫瘤組學數據。簡要步驟如下：①通過TCGA 數據庫選擇“Esophageal carcinoma”全部下載所有可比的mRNA 表達譜、RNAseq 或基因表達譜芯片的數據并進行手工篩選；②采用UALCAN 交互式網絡工具選擇“Esophageal carcinoma”數據庫集并與TCGA 數據庫下載文檔進行比對，包括食管組織(包括巴雷特食管)組織及癌旁正常食管組織、食管腺癌、食管鱗癌3 種mRNA 表達譜、RNAseq 或基因表達譜芯片數據納入的分析，并比對兩個數據庫所獲得組織的差異，最終確定納入研究的組織隊列；③在UALCAN 網站界面的Enter gene symbol(s)框中輸入SCL25A1，以及在TCGA dataset 下拉菜單輸入“Esophageal carcinoma”，選擇表達譜“Expression” 比 較， 獲 得Normal-vs-Primary 隊 列SLC25A1 的表達差異分布圖，包括納入樣本量、極值、中位數、四分位數及P 值，在下拉菜單的亞組分析選擇“Histology type”比較，獲得Normal-vs-Adenocarcinoma 和Normal-vs-Squamous-cell-carcinoma的表達差異分布圖、樣本量、極值、中位數、四分位數及P值。

1.2.2 放射克隆存活法分析細胞放射敏感性放射敏感細胞和放射抵抗細胞株常規6 孔培養板按3 種細胞密度接種(分別為500、1 000、2 000 個/孔)，待細胞貼壁后，培養板上層覆蓋1.0 cm 補償膠，皮源距100 cm，等中心照射，深度d=2.5 cm，吸收率為200 cGy/min，分別暴露于燈光野假照射(Sham-radiation)，1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 Gy 的梯度劑量的X-射線下(6 MeV)，照射后繼續培養14～18 d，結晶紫染色，50個細胞以上克隆計數。按公式計算克隆效率和生存分數：

以未經X-射線照射細胞為對照。采用GraphPad Prism 5.0 軟件，按照線性二次方程模型S=e-aD-BD2擬合劑量反應曲線，其中S 為生存分數，a 和b 為常數，D 為劑量，按積分法計算存活曲線下面積(area under the curve，AUC)和放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)。

1.2.3 穩定敲低SLC25A1 表達食管癌細胞系構建取對數生長期KYSE150-R 細胞，每孔10 000 個細胞接種于6 孔板中，完全培基細胞接種過夜后，RPMI-1640 培 養 基 洗 滌 六 孔 板5 次， 采 用250 μL Lipofectamin 2000 包被2.0 μg pLent-U6-GFP-SLC25A1 shRNA質粒及對照組Scramble shRNA質粒，分別轉染細胞，8 h后更換完全培養基，24 h后依照TRIZOL法提取RNA，檢測4 種質粒敲低SLC25A1 的效率，選擇敲低效率超過80%以上的兩個質粒作為后續慢病毒感染質粒。按照試劑說明書中慢病毒感染試劑操作步驟感染KYSE150-R 細胞，用于篩選的嘌呤霉素濃度為1.6 μg/mL，選取耐藥和表達綠色熒光的單克隆繼續篩選完全培基中加入0.8 μg/mL 嘌呤霉素進行培養，并鑒定上述耐藥具有熒光的克隆，最終獲得2～3 株經免疫印跡法鑒定的穩定敲低SLC25A1 表達的KYSE150-R細胞。

1.2.4 Hoechst 染色檢測細胞凋亡取對數生長期KYSE150和KYSE150-R細胞，以每孔5 000個細胞接種于6 孔板中，完全培基細胞接種過夜后，次日開始給予常規分割放射(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1 次/d×5 d)處理細胞，對照組細胞給予假照射處理，繼續培養24 h，收集貼壁細胞，多聚甲醛冰上固定20 min，5 μg/mL Hoechst 33258 溶液重懸細胞避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察典型的凋亡細胞在形態學上可出現染色質固縮，核碎裂以及核發泡等改變。凋亡細胞百分比計算方法為：在5 個隨機顯微鏡視野下選取200個細胞計算其中的凋亡細胞數目，重復3次。

1.2.5 流式細胞術ROS 檢測法取對數生長期KYSE150和KYSE150-R細胞，以每孔5 000個細胞接種于6 孔板中，完全培基細胞接種過夜后，次日開始常規分割放射(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1次/d×5 d)處理細胞，對照組細胞給予假照射處理，繼續培養24 h，收集貼壁細胞，按碧云天公司ROS 流式檢測試劑盒操作說明，簡要步驟如下按照1∶1 000稀釋加入的二 氯 雙 氫 熒 光 素 二 乙 酸 酯 (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)染 色液，終濃度為10.0 μmol/L，避光孵育15 min，隨后采用無血清1 640 培養基洗滌3 次，上機流式細胞儀檢測熒光強度，激發光488 nm，發射光525 nm，實驗重復3次。

1.2.6 免疫印跡法加蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的NP-40 細胞裂解液處理待檢測細胞，于冰上裂解45 min，常規細胞刮取細胞；4 ℃，50 W 功率超聲2 s，125 000 g離心30 min，吸取上清，BCA法蛋白定量，常規煮沸變性5 min，樣品蛋白上樣量為每泳道60 μg，10% SDS-PAGE變性凝膠電泳，電泳條件：積層膠50 V，分離膠120 V恒定電壓電泳分離，全濕三明治法電轉條件：恒定電流100 mA，電轉移時間1.5 h，印跡膜為0.22 μm的PVDF膜。5%BSA室溫下封閉1 h，隨后分別加入下列不同稀釋比例的一抗4℃冰箱孵育過夜(β-actin一抗按1∶5 000稀釋；SLC25A1一抗按1∶500 稀釋；磷酸化H2A.X(Ser139)和磷酸化DNAPKcs(Ser2056)、H2AX、DNA-PKcs 均按1∶1 000 稀釋)，室溫下加入二抗孵育1.5 h(均按1∶5 000 稀釋)，加發光劑后壓片5～10 min，顯影定影3～5 min，采用300 dpi對膠片掃描導入條帶分析軟件分析。

1.3 統計學方法

計數資料采用均數±標準差表示，計量資料采用頻數表示，均數兩兩比較采用SPSS 15.0 軟件行t 檢驗，體外放射克隆存活曲線采用線性二次方程模型擬合；以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 TCGA 數據庫食管癌與正常組織SLC25A1 基因表達的差異

通過阿拉巴馬大學伯明翰分校UALCAN交互式網絡工具分析TCGA 數據庫中食管癌組織與正常組織的SLC25A1基因表達水平的差異(圖1)。結果顯示，納入食管癌組織184例，正常食管組織11例。與正常食管組織比較，食管癌組織(不分組織類型)中SLC25A1 基因表達升高1.65 倍(P=1.64×10-4)；其中，食管腺癌升高1.63倍，食管鱗癌升高1.72倍(P均＜0.05)。

圖1 TCGA數據庫食管癌組織與正常組織SLC25A1基因表達水平差異

2.2 放射抵抗和放射敏感食管鱗癌細胞系SLC25A1基因差異表達

采用6 MeV X射線多輪亞致死劑量暴露法篩選并建立放射抵抗和放射敏感的食管鱗癌KYSE150-R 和KYSE150細胞株，并采用放射克隆存活實驗線性二次方程靶模型驗證細胞系放射敏感性。結果顯示，KYSE150-R 細胞株LQ 模型克隆存活曲線下面積(AUC=1.834)與對照組比較(AUC=1.536)上調(P＜0.05；SER2Gy=0.84)(圖2A、B)，提示成功構建放射抵抗食管鱗癌細胞株及對照放射敏感細胞株。免疫印跡和qPCR 法對兩株細胞檢測結果證實，與對照組KYSE150 比 較， 放 射 抵 抗KYSE150-R 細 胞 株SLC25A1 蛋白和mRNA 水平表達均上調(P＜0.05)(圖2C、D)。

圖2 放射抵抗食管癌細胞株與放射敏感細胞株SLC25A1基因表達水平差異

2.3 SLC25A1 穩定敲低對放射抵抗食管鱗癌細胞凋亡的影響

首先構建SLC25A1 穩定改變的放射抵抗食管鱗癌細胞，采用4 種SLC25A1 shRNA 質粒及對照組Scramble shRNA 分別轉染KYSE150-R 細胞，qPCR 法檢測SLC25A1 mRNA 表達改變，結果證實SLC25A1 shRNA1 和SLC25A1 shRNA3 干擾效率超過70%，可作為有效干擾質粒(圖3A)；采用SLC25A1-shRNA1 和SLC25A1 shRNA3 質粒包裝慢病毒并感染細胞，成功構建并免疫印跡法驗證2 株穩定敲低SLC25A1 的KYSE150-R細胞(圖3B)。

為了分析SLC25A1 基因在食管癌放射抵抗中的作用機制，采用多分割放射X-射線(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1 次/d×5 d)照射KYSE150-R/SLC25A1 KD 細胞株及對照KYSE150-R/Scramble shRNA-NC 細胞株，Hoechst染色凋亡形態學檢測分析結果證實，與對照組[(17.94±5.20)%]比較，KYSE150-R/SLC25A1 KD細胞株凋亡率[(28.35±6.30)%]顯著增加1.58 倍(P＜0.05)(圖3C)。同時，放射克隆存活實驗線性二次方程靶模型證實，與對照組比較(AUC=1.96)，KYSE150-R/SLC25A1 KD 細胞株LQ 模型克隆存活曲線下面積(AUC=1.61)顯著降低(P＜0.05；SER2Gy=1.22)(圖3D)。

圖3 SLC25A1基因穩定敲低誘導食管癌細胞株凋亡增強放射敏感性

2.4 SLC25A1通過抑制DNA損傷修復誘導放射增敏

為了分析SLC25A1 基因是否通過調控ROS 水平誘導放射增敏的作用，采用多分割放射X-射線(總劑量6 Gy，1.2 Gy/次，1 次/d×5 d)照 射KYSE150-R/SLC25A1 KD 細胞株及對照KYSE150-R/Scramble shRNA-NC 細胞株，流式細胞術檢測ROS 水平結果顯示，與對照組比較，KYSE150-R/SLC25A1 KD細胞株ROS 水平降低了(65.3±14.3)%(P=0.007)(圖4A～B)。隨后，采用免疫印跡法分析敲低SLC25A1對放射誘導的DNA 損傷修復關鍵分子信號傳導的影響，結果證實，與對照組比較，KYSE150-R/SLC25A1 KD細胞株的磷酸化H2AX(Ser139)和磷酸化DNA-PKcs(Ser2056)水平顯著降低(圖4C)。

3 討 論

食管鱗癌是放化療敏感的惡性腫瘤，同步放化療是目前局部晚期不可手術切除的食管癌標準治療方案[3]。然而，放療靶病灶內殘留生存的腫瘤細胞發生局灶復發和遠處轉移，導致腫瘤治療失敗，影響腫瘤患者預后，已成為臨床上腫瘤治療的棘手問題[2-3]。目前，放療靶區內腫瘤復發的分子機制仍不清楚，而獲得性放射抵抗被認為是其關鍵影響因素。溶質轉運體SLC25A1[7-8，11]通過調控檸檬酸的跨線粒體轉運，具有保護線粒體損傷和通過自噬途徑抑制線粒體損耗的作用，在代謝活躍和高增殖的組織中參與維持線粒體內穩態和生物能量生產，并參與調控ROS水平。本研究以我國發病率較高且放療作為主要治療方法瘤種——食管鱗癌為研究對象，以獲得性放射抵抗模型為切入點，采用國際通用的TCGA 腫瘤組織數據庫分析證實食管癌與正常組織存在SLC25A1表達上調，放射抵抗食管鱗癌細胞存在SLC25A1表達上調，并采用體外放射模型初步證實下調SLC25A1表達通過抑制DNA損傷修復機制，進而誘導食管癌細胞凋亡的分子機制，為進一步篩選食管癌放射增敏分子靶點和臨床轉化提供實驗依據。

圖4 穩定敲低SLC25A1通過抑制DNA損傷修復誘導放射增敏

首先，本研究采用UALCAN交互式網絡工具分析TCGA 數據庫中食管癌組織與正常組織的SLC25A1 表達差異，結果證實，與正常食管組織比較，食管癌組織、食管鱗癌組織、食管腺癌組織SLC25A1 基因mRNA 水平表達均顯著升高。隨后，我們采用多輪亞致死劑量暴露法成功建立放射抵抗和放射敏感對照組食管鱗癌細胞株(KYSE150-R 和KYSE150 細胞)。隨后進一步證實，放射抵抗食管鱗癌細胞株存在SLC25A1蛋白表達水平和mRNA 表達水平顯著上調。與SLC25A1 在乳腺癌、肺癌、結腸癌等腫瘤組織的報道類似[7-8]，SLC25A1 在多種腫瘤中可能作為一種潛在癌基因參與腫瘤發生、惡性表型維持以及化療耐藥。結合本研究結果提示，SLC25A1 基因可能作為一種致癌基因參與食管癌發病和放射抵抗等惡性表型。在生理學功能方面溶質轉運體SLC25A1 主要通過調控檸檬酸的跨線粒體轉運維持線粒體內穩態并參與氧化磷酸化過程[12]，而在光子放射誘導的氧化應激和放射抵抗條件下SLC25A1 發揮何種功能仍未充分研究。為了進一步分析SLC25A1 是否參與食管鱗癌放射抵抗，本研究成功構建SLC25A1 敲低的放射抵抗食管鱗癌細胞株(KYSE150-R/SLC25A1 KD1 和KYSE150-R/SLC25A1 KD3)及對照組細胞株。通過穩定敲低SLC25A1 表達分析放射誘導的細胞凋亡以及對食管鱗癌體外放射敏感性的影響，結果證實，敲低SLC25A1 表達可增加放射誘導的細胞凋亡，并部分逆轉食管癌細胞體外放射抵抗而誘導放射增敏。一般而言[13]，放射線及其誘導產生過量的ROS 損傷DNA 等生物大分子，誘導腫瘤細胞凋亡，發揮放射治療作用。為了分析SLC25A1 是否通過ROS水平調控參與放射抵抗過程，本研究采用流式細胞術檢測多分割亞致死劑量下放射抵抗細胞株中ROS水平。然而與預期相反，在多分割放射條件下，放射抵抗食管鱗癌細胞株敲低SLC25A1 基因表達并未如預期ROS水平升高而是出現ROS水平具有統計學意義的輕微降低(P＜0.05)(圖4)。我們推測出現這種差異性現象的原因，ROS水平在不同條件下對細胞的作用存在爭議[14]。一方面，模型選擇上放射抵抗食管鱗癌細胞株在基線水平具有耐受多分割光子射線能力，反映出放射抵抗細胞株耐受高水平ROS所誘導的細胞凋亡作用；另一方面亞致死劑量照射可激活細胞DNA損傷修復能力具有抵抗凋亡的作用。隨后，采用免疫印跡法分析SLC25A1敲低對放射誘導的DNA損傷修復關鍵分子信號的影響，結果進一步證實，敲低SLC25A1 基因表達通過抑制DNA損傷修復能力誘導放射抵抗食管鱗癌細胞株。值得注意的，大量研究證實[15-16]，ROS 水平對細胞的作用存在差異，亞致死劑量放射線誘導適度的ROS水平參與腫瘤放射抵抗而過量的ROS水平通過細胞死亡配體信號途徑誘導細胞凋亡，而低水平的ROS 具有維持適度氧化應激作用發揮相應的生理功能。人類SLC25A1 的同源果蠅scheggia(sea)編碼Sea 蛋白的突變，通過影響檸檬酸鹽從線粒體向細胞質的運輸，敲低Sea 可誘導細胞周期阻滯，而通過短干擾RNA(siRNA)處理的人類原代成纖維細胞，SLC25A1 表達敲低導致染色體斷裂和組蛋白乙酰化缺陷，提示SLC25A1具有維護染色體完整性方面具有進化保守作用[17]。本研究發現通過在放射抵抗食管癌細胞株敲低SLC25A1表達聯合X-放射線暴露處理，可誘導細胞凋亡增加。我們推測敲低SLC25A1 通過誘導細胞周期阻滯、誘導染色體斷裂和組蛋白乙酰基化缺失和抑制DNA 損傷修復等方面，破壞染色體完整性，增強X-射線誘導的食管癌細胞死亡，具有逆轉放療抵抗的潛力。因此，本研究提示SLC25A1 在亞致死劑量X 射線暴露下通過維持細胞ROS水平，增強DNA損傷修復能力，誘導細胞抗凋亡作用，而下調SLC25A1 表達具有克服放射抵抗的作用的潛力，但需要評估氧化磷酸化和氧耗率差異并采用裸鼠移植瘤放射動物體內模型進一步驗證。

綜上所述，TCGA 數據庫比較食管癌與正常組織差異比較證實食管癌組織存在SLC25A1 表達上調；多輪亞致死劑量暴露法構建的放射抵抗食管鱗癌細胞株也存在SLC25A1 表達上調；SLC25A1 可能作為一種參與放射抵抗和腫瘤發病的候選癌基因。放射抵抗食管癌細胞系敲低SLC25A1表達，通過下調ROS水平抑制DNA 損傷修復誘導細胞凋亡，發揮放射增敏作用。SLC25A1 可作為一種潛在的食管鱗癌放射增敏分子靶點。