鐵死亡信號介導抗腫瘤作用的細胞器調控機制研究進展

郭倪君，林忠寧，林育純*

(分子疫苗學和分子診斷學國家重點實驗室，廈門大學公共衛生學院，福建 廈門 361102)

鐵死亡作為新近發現的一種調節性細胞死亡(regulated cell death，RCD)方式，其信號通路參與致癌和抗腫瘤作用的調控[1]。研究表明，鐵死亡信號分子的蛋白質翻譯后修飾(posttranscription modifications，PTMs)參與鐵死亡調控；外源化學物作用下，不僅細胞內各個細胞器和多細胞器之間串話可介導鐵死亡信號，觸發鐵死亡信號的某一細胞也可通過細胞間通訊介導損傷相關分子模式或外泌體等將鐵死亡信號傳遞從而形成傳播性細胞死亡[2]。本文以鐵死亡信號通路為線索，綜述多細胞器參與鐵死亡的執行機制，列舉誘導鐵死亡的藥物、植物化學物和納米粒子等介導的抗腫瘤作用，旨在為致癌作用和腫瘤化學預防提供科學依據。

1 抗癌作用相關的鐵死亡信號分子及其調控

1.1 鐵死亡的生物學特征

鐵死亡是一種可被天然刺激或外源合成誘導劑作用下發生的鐵依賴性脂質過氧化(lipid peroxidation，LPO)介導的RCD；最初于2003年在小分子Erastin選擇性殺死致癌RAS基因突變的人成纖維瘤BJ 細胞中被觀察到；2012 年Stockwell 等正式使用“ferroptosis”來描述這種可誘導的非凋亡性RCD 形式[1]，此后與鐵死亡相關的信號通路及其調節機制日益被證實。

鐵死亡細胞形態學上主要表現為線粒體變小、嵴減少或消失、膜皺縮和外膜破裂。Dixon等歸納了鐵死亡細胞的3個基本特征，即還原性鐵的激活、含多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的磷脂的過氧化、脂質過氧化物修復功能損失[1]。外源因素誘導的鐵死亡通路涉及蛋白質(如谷胱甘肽過氧化物酶4，glutathione peroxidase 4，GPX4)、脂質(如PUFA)和氨基酸(如半胱氨酸)等調節因子構成的信號網絡的調控。這些特征完全不同于其他RCD，具體獨特的生物學特性見表1。鐵死亡與自噬存在關聯，當細胞響應于鐵死亡誘導劑后，自噬小體積聚、細胞內鐵貯存蛋白的鐵蛋白降解、鐵水平上調，促進細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累而引發鐵死亡；自噬激活可有利于細胞鐵死亡，敲低自噬相關基因可抑制鐵死亡；自噬抑制劑氯喹(chloroquine，CQ)也可防止依賴于鐵死亡的組織損傷[3]。此外，分子伴侶介導的自噬(chaperonemediated autophagy，CMA)參與鐵死亡過程，Erastin 誘導CMA分子標志的溶酶體相關膜蛋白2A 水平增加可促進GPX4 降解，而抑制CMA可穩定GPX4并減少鐵死亡[4]。

1.2 誘導鐵死亡的執行信號通路

誘導性鐵死亡的執行信號主要經由兩條典型途徑(圖1)。一是游離鐵或含鐵脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)負責氧化膜PUFA、進而導致脂質ROS 的形成。鐵可經由轉鐵蛋白(transferrin，TRF)進入細胞；通過限制鐵攝取，可使轉鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)介導的轉鐵蛋白-鐵復合物下調，抑制鐵死亡[10]。二是清除磷脂氫過氧化物的GPX4 的失活或抑制。胞外胱氨酸耗竭或胱氨酸/谷氨酸逆向轉運子(cystine/glutamate antiporter system，System Xc-)、轉硫途徑及谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成被抑制可間接抑制GPX4；Ras選擇性致死復合物3(Ras selective lethal compound 3，RSL3)等類似結構化合物可通過共價修飾直接抑制GPX4 功能，以不改變細胞內GSH水平的方式誘導鐵死亡[11]。

1.3 鐵死亡作為新的腫瘤標志信號

鐵死亡通路調節因子與多種已知的腫瘤標志存在關聯性。Chen等發現RSL3可抑制神經膠質瘤U87細胞中活化轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)過表達，誘導腫瘤標志之一的血管生成增強；而溶質載體家族7 成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)是ATF4的驅動因素，提示鐵死亡耐受與腫瘤的血管生成信號有關[12]。Heike等發現腎透明細胞癌表現為極強的代謝重編程能力，抑制β-氧化或線粒體ATP合成在腫瘤抑制基因VHL重建細胞中可恢復鐵死亡敏感性，提示腫瘤標志之一的能量代謝信號與鐵死亡的微妙關系[13]。Wang等發現程序性死亡配體1抗體聯合降解胱氨酸和半胱氨酸的工程酶，可協同增強小鼠卵巢癌ID8細胞荷瘤小鼠中鐵死亡特異性LPO，機制是激活CD8+T 細胞釋放干擾素γ，直接抑制System Xc-表達；提示胱氨酸限制是誘導腫瘤微環境中腫瘤細胞鐵死亡的潛在內源觸發因素，腫瘤細胞鐵死亡是CD8+T細胞介導腫瘤清除的另一機制，靶向腫瘤中鐵死亡相關代謝信號通路可改善癌癥免疫療法的功效[14]。Wu 等發現E-鈣黏蛋白高表達、激活的腫瘤抑制因子神經纖維瘤膜蛋白2 及促增殖Hippo 信號傳導途徑可抑制鐵死亡，并經由鐵死亡參與腫瘤細胞間通訊；該信號軸中任一因子的惡性突變可以預測人結腸癌細胞對誘導鐵死亡介導抗腫瘤的反應性[15]。因此，鐵死亡通路信號分子的篩查可為外源因素誘導致癌作用和腫瘤預防控制提供潛在生物標志。

表1 不同RCD的主要細胞生物學特征比較

圖1 外源化學物經由多細胞器參與鐵死亡信號網絡調控的抗腫瘤機制示意圖

1.4 鐵死亡信號分子的PTMs調控

參與鐵死亡調節的諸多信號分子受PTMs的調控。Sun等在Erastin 處理人宮頸癌Hela 細胞中觀察到蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導熱休克蛋白β1(heat shock protein β1，HSPB1)磷酸化，進而減少細胞鐵攝取及脂質ROS促進鐵死亡抗性；在小鼠荷瘤模型中發現抑制HSPB1磷酸化可增加Erastin的抗癌活性[16]。Song等揭示Erastin誘導AMP活化蛋白激酶(AMPactivated protein kinase，AMPK)介導HCT116 細胞中自噬調節因子Beclin 1 磷酸化，通過與SLC7A11 結合，抑制System Xc-通路介導鐵死亡[17]。Chen等驗證在鐵死亡期間電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白2(voltage-dependent anion selective channel protein 2，VDAC2)的內源性羰基化，VDAC2C210A突變的人纖維肉瘤HT1080 細胞能免于RSL3 誘導的鐵死亡，提示半胱氨酸210(Cys210)位點的修飾與促細胞鐵死亡有關[18]。Kerins 等通過藥物敏感性基因特征的研究，發現鐵死亡誘導劑對富馬酸(fumarate，FH)缺失的人腎癌UOK262細胞具有選擇性毒性，是由于GPX4Cys93易發生富馬酸修飾，提示靶向FH 失活細胞可作為誘導鐵死亡的抑癌策略[19]。Wang等采用乙酰轉移酶處理非小細胞肺癌H1299細胞，發現p53中賴氨酸98(K98)位點乙酰化可誘導鐵死亡、且不受已知位點(K117/161/162)乙酰化狀態的影響[20]。因此，鐵死亡信號通路調節分子的PTMs調控是外源因素誘導鐵死亡發生發展的潛在分子機制。

2 不同細胞器參與鐵死亡調節的信號網絡調控機制

2.1 線粒體參與鐵死亡調節

線粒體作為細胞死亡及存活信號整合的關鍵細胞器平臺，促成多種RCD 的發生[21]。Krainz 等合成靶向線粒體ROS 的清除劑XJB-5-131，發現其比廣泛ROS 清除劑能更有效抑制HT1080 等細胞鐵死亡的發生[22]。Yuan 等發現Erastin 以鐵依賴性方式促進人肝癌HepG2和Hep3B細胞線粒體外膜上含鐵蛋白CDGSH 鐵硫結構域蛋白1(CDGSH iron sulfur domain 1，CISD1)表達；抑制CISD1 表達可增加鐵介導的線粒體內LPO 和有助于誘導鐵死亡；吡格列酮穩定CISD1的鐵硫簇可抑制鐵死亡；表明CISD1 在保護細胞免受鐵死亡中的新作用[23]。Gao 等通過Erastin 直接抑制System Xc-及限制HT1080 細胞的半胱氨酸攝入和合成，確證了線粒體只是對于半胱氨酸缺乏誘導的鐵死亡是必不可少；而單純通過RLS3直接抑制GPX4誘導細胞鐵死亡，卻不是線粒體依賴性的[24]。因此，線粒體在鐵死亡中的作用可能與細胞類型(如不同腫瘤細胞等)、不同受試物(如抗癌藥物等)誘導的RCD(包括鐵死亡)的調節信號網絡有關。

2.2 內質網參與鐵死亡調節

內質網(endoplasmic reticulum，ER)穩態的失調可激活ER應激，誘發未折疊蛋白反應。與鐵死亡相關的ER 應激信號是由ATF4介導C/EBP同源蛋白通路激活，且該通路介導p53非依賴性的p53上調凋亡調節因子參與了鐵死亡與凋亡之間的相互串話[25]。Dixon 等通過Erastin 和索拉非尼(sorafenib，Sora)誘導HT1080細胞鐵死亡模型RNA測序顯示ER應激信號通路分子激活，證明了ER應激與觸發鐵死亡的關聯；提示靶向ER信號通路的調控在誘導鐵死亡相關腫瘤化學預防中的作用[26]。Kagan等使用RSL3 處理小鼠胚胎成纖維Pfa1 細胞，發現脂質ROS 主要積累在線粒體基質外和ER上[27]；基于ER與線粒體之間密切接觸和功能偶聯的膜結構，即線粒體相關性內質網膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)的研究，提示MAM 介導的多細胞器間通信網絡的調控在鐵死亡參與致癌發生和抗腫瘤中的作用值得探究。

2.3 溶酶體參與鐵死亡調節

溶酶體可降解蛋白質、脂質和損傷的細胞器，參與不同RCD 的生物信號傳遞功能[28]。Mancias 等揭示CQ 誘導乳腺癌MCF-7 細胞中核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4，NCOA4)可與鐵蛋白N端結合將其運輸至溶酶體，介導鐵蛋白自噬(ferritinophagy)過程，表明NCOA4 對鐵穩態與鐵死亡的重要性[29]。Torii 等發現脂質過氧化物與溶酶體共定位，且溶酶體抑制劑(如CQ 等)可減弱TRF 的細胞內轉運或鐵蛋白自噬降解、部分阻止細胞內鐵的供應來抑制鐵死亡[30]。Yang 等揭示CQ和早期自噬抑制劑spautin-1均能抑制RSL3誘導人非小細胞肺癌Calu-1細胞鐵死亡，是由于核心生物鐘蛋白——芳香烴受體核轉運蛋白被泛素結合蛋白p62介導轉運至溶酶體降解(該過程稱為“clockophagy”)，促使缺氧誘導因子1α去穩定化而發生鐵死亡；阻斷clockophagy 及其后續信號可抑制鐵死亡[31]。這些研究表明，溶酶體經由介導鐵代謝和部分LPO參與腫瘤細胞中的鐵死亡信號調節；因此，基于溶酶體能直接參與其他細胞器降解的功能[28]，其與細胞器之間的通訊介導的鐵死亡有待進一步探明。

2.4 細胞核參與鐵死亡調節

細胞核是致癌作用預防、抗腫瘤藥物治療和基因干預的理想靶標。與細胞凋亡時核DNA斷裂和染色質固縮相比，鐵死亡細胞核形態無明顯改變[32]。細胞核中主要的兩個鐵死亡信號分子為p53 和核因子紅細胞2 相關因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)。Jiang 等發現Erastin 誘導入核的胞核p53 在轉錄水平下調SLC7A11 表達，促進MCF-7 細胞及骨肉瘤U2OS細胞的LPO及鐵死亡[33]。Xie等發現Erastin 處理HCT-116細胞中，胞膜上蛋白二肽基肽酶-4(dipeptidyl-peptidase-4，DPP4)與NADPH 氧化酶1(NADPH oxidase 1，NOX1)解離入核，與核p53 結合、抑制SLC7A11 的轉錄，誘導鐵死亡耐受，提示信號分子競爭性結合核p53 可抑制鐵死亡[34]。Mao 等發現Erastin 處理肺癌A549 細胞后GTPase 活化蛋白結合蛋白1(GTPase-activating protein-binding protein 1，G3BP1)的互作結構域可與p53 相關胞質lncRNA(P53RRA)結合互作，使胞質p53游離并入核致細胞周期停滯、凋亡和鐵死亡[35]。Sun等發現Sora作用的HepG2 細胞中，Nrf2 易位至細胞核，上調金屬硫蛋白-1G 基因的轉錄，增強該基因敲低的荷瘤裸鼠中Sora 的抗癌活性，提示Nrf2介導的鐵死亡敏感性[36]。因此，參與鐵死亡調控的核信號分子可以成為潛在的抗癌作用靶標。

3 外源化學物經由鐵死亡信號網絡調控抗腫瘤作用

3.1 合成藥物在鐵死亡誘導性腫瘤化學預防中的作用

Stockwell 等根據鐵死亡發生途徑歸納了4 類鐵死亡誘導性合成藥物，已有2類在腫瘤研究性實驗中得到運用。Ⅰ類誘導劑Erastin及其同源物咪唑酮Erastin、哌嗪Erastin、以及抗炎藥物柳氮磺胺吡啶和肝癌化療藥物Sora 等，通過抑制System Xc-的功能、限制胱氨酸輸入而導致下游GSH耗盡及GPX4活性喪失[1]。Zhang等采用Ⅰ類誘導劑作用于野生型、穩定高表達腫瘤抑制因子BRCA1 相關蛋白1(BRCA1-associated protein 1，BAP1)和BAP1 突變型的人腎癌UMRC6 細胞，觀察到僅穩定高表達BAP1的細胞中降低了SLC7A11啟動子上的組蛋白2A去泛素化作用的利用率，以去泛素化依賴性方式抑制SLC7A11表達促進鐵死亡[37]。Ⅱ類誘導劑RSL3、ML162 等小分子可與GPX4酶結構中的親核活性位點硒代半胱氨酸共價相互作用，直接抑制GPX4 酶活性和致細胞脂質氧化還原修復功能喪失而誘導鐵死亡；但由于其低溶解度和難以表征藥代動力學，Ⅱ類鐵死亡誘導性化學物暫不適合于人體臨床試驗[9]。

3.2 植物化學物在鐵死亡關聯性腫瘤化學預防中的作用

植物化學物具有良好的選擇性和較低的毒性副作用的特點，已發現部分可誘導腫瘤細胞鐵死亡。Lin 等發現青蒿素(artemisinin，ART)及其衍生物青蒿琥酯(dihydroartemisinin，DHA)可介導頭頸部癌HEP-2 細胞中不穩定鐵池(liable iron pool，LIP)增加，破壞鐵依賴性細胞穩態誘導鐵死亡[38]。Du 等發現DHA可誘導急性髓性白血病HL60和KG1細胞自噬、加速鐵蛋白降解、增加LIP 促進鐵死亡；鐵硫簇裝配酶的過表達及鐵蛋白重鏈蛋白的重新表達均可抑制鐵死亡，提示DHA經由鐵代謝參與鐵死亡[39]。此外，天然生物堿中的蓽撥亭能顯著增加PANC-1 細胞LPO 水平，經由鐵死亡對腫瘤細胞產生毒性[40]；Wei等合成天然產物中三萜皂苷類似化合物D13作用于HCT116細胞，經由p53線粒體依賴性途徑誘導鐵死亡和凋亡的同步發生，增加抗腫瘤敏感性[41]。因此，天然植物化學物及衍生物經由鐵死亡信號的腫瘤細胞毒性作用有望成為早期腫瘤化學預防的新方向。

3.3 納米粒子在鐵死亡誘導性腫瘤化學預防中的作用

由于納米粒子的高負載、較強滲透性及保留效應、特異性靶向、可控釋放和成像等特點，多種鐵基納米粒子的改造和修飾，已成為增強誘導腫瘤細胞鐵死亡的鐵死亡療法的載藥載體[42]。Zheng 等將聚乙烯亞胺/p53 質粒復合物與Fe3+、Fe2+及多酚物質單寧酸(tannic acid，TA)共價結合形成金屬有機網絡-p53(metal-organic network-p53，MON-p53)納米顆粒，既抑制SLC7A11 又介導芬頓反應增加ROS，雙重主導促進HT1080 細胞鐵死亡[43]。Liu等合成Sora@Fe III TA納米顆粒，在小鼠乳腺癌4T1細胞的溶酶體酸環境中電暈解離，釋放Sora以抑制GPX4促進鐵死亡[44]。Wang 等發現富含精氨酸的硅酸錳納米泡(arginine-rich manganese silicate nanobubbles，AMSNs)可增強GSH 消耗效率，抑制GPX4 以促進人肝癌Huh-7 細胞鐵死亡；期間AMSNs 的降解也有助于T1 加權的磁共振成像增強及用于協同治療藥物按需釋放[45]。Shen 等將Fe3O4/Gd2O3雜化納米顆粒、乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)和順鉑(cisplatin，cDDP)合成FeGd-HN@Pt@LF/RGD2-cDDP 綴合物，通過內吞作用內化到U87 細胞中，經內體攝取和降解時釋放鐵離子和cDDP 加速芬頓反應產生ROS 誘導癌細胞鐵死亡[42]。Zhang 等利用Fe3O4磁性納米團簇(nanocluster，NC)為核心，加載白細胞膜、轉化生長因 子β 抑 制 劑(TGF-β inhibitor，Ti)、程 序 性 死 亡 蛋 白-1(programmed cell death protein 1，PD-1)抗體(Pa)合成Pa-M/Ti-NCs，尾靜脈注射給予4T1 細胞荷瘤裸鼠，Pa 和Ti 在荷瘤組織中互作產生免疫原性微環境，加強極化M1 型巨噬細胞芬頓反應誘導原位瘤細胞鐵死亡[46]。因此，將鐵死亡調控機制與納米顆粒的特性結合，可增加新型納米醫藥在腫瘤防治中的優勢。

4 總結與展望

環境因素暴露介導細胞應激和損傷的動態調控過程，涉及不同細胞器參與的RCD信號網絡調節機制，是致癌作用篩查和干預以及腫瘤化學預防研究的焦點，為充分利用鐵死亡，將其開發為抑制腫瘤進展的新應用提供依據。因此，仍需進一步探討致癌和抗腫瘤過程中鐵死亡的新調節通路。首先，機制方面，鐵死亡中LPO下游的分子標志、鐵死亡具體分子執行者等尚不清楚；其次，鐵死亡與其他RCD并行調控細胞結局、多細胞器間膜接觸和信號串話、信號網絡分子間的互作及其PTMs修飾等的功能學調控值得深入研究；第三，應用方面，鐵死亡抑制劑在外源物誘導致癌過程中的干預、鐵死亡誘導劑在實驗研究和臨床(前)期試驗中殺死癌細胞的具體效果未有確切結論。因此，本文有助于為今后開發靶向鐵死亡信號網絡中相關分子及細胞器調控的合成藥物、植物化學物及納米粒子等提供科學依據。