羥胺三氯化鐵法測定人血清膽堿酯酶方法的優化

徐海明，郝艷星，陳婭楠，楊惠芳，李江平，朱玲勤，任彬彬，德小明

(寧夏醫科大學公共衛生與管理學院職業衛生與環境衛生學系，寧夏 銀川 750004)

人體內的膽堿酯酶(cholinesterase，ChEs)按照水解底物的差異可分為乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和丁酰膽堿酯酶(butyrocholinesterase，BChE)。50 年代初期，AChE 就用來評價有機磷農藥、氨基甲酸酯類農藥中毒情況。有越來越多的證據表明，人體內的ChEs 發揮著越來越多的生理學功能[1-2]。具體來說，AChE 與細胞黏附、增殖、凋亡等生理活動密切相關[3-4]；BChE 既與解毒存在密切關聯，同時被應用到惡性腫瘤預后分析及臨床疾病診斷等領域[5-8]。

定量檢測ChEs 的方法有很多，主要包括改良Ellman法、丁酰硫代膽堿/六氰高鐵酸鉀(Ш)法(由德國臨床化學協會推薦，簡稱DGK 法)、P-羥基苯甲酰膽堿偶聯對羥基苯甲酸-3-單加氧酶法(日本臨床化學協會推薦，簡稱JSCC 法)、羥胺三氯化鐵法(標準號為WS/T66-1996)。

羥胺三氯化鐵法測定ChEs得到了廣泛應用，但呈現出一定的應用局限性，比如不適合通量測定，需在較短時間內完成比色測定，容易產生沉淀等。本研究旨在對羥胺三氯化鐵法進行條件優化，以改進上述不足，達到微孔板測定的目的。

1 材料與方法

1.1 血清標本及試劑

本研究中所用到的人體血清標本來自寧夏某職業病防治醫院在崗期間進行職業健康體檢的長期吸入游離二氧化硅的作業人員。本研究得到了寧夏醫科大學醫學倫理委員會批準并獲得所有研究對象的知情同意。本研究中用到的主要試劑如表1所示。

表1 膽堿酯酶測定試劑

1.2 方法

1.2.1 羥胺三氯化鐵法測定人血清標本中AChE酶活性在參照測定全血膽堿酯酶活性的分光光度法(羥胺三氯化鐵法WS/T66-1996)的基礎上，對部分實驗細節進行調整：將凍存于-80 ℃人體血清放置于-4 ℃緩慢融化。對照管和樣品管各加20 μL 人體血清，10 μL iso-OMPA 抑制劑，用PBS 溶液補足至1 mL。使用可見分光光度計(VIS-7220N，北京北分瑞利)測定AChE的吸光度時，用蒸餾水調零，其余步驟、條件及酶活性計算方法參照羥胺三氯化鐵法(WS/T66-1996)。

1.2.2 羥胺三氯化鐵法測定人血清標本中BChE酶活性參照本實驗優化的羥胺三氯化鐵法測定AChE 酶活性實驗方案與預實驗結果，對部分實驗細節微調：加入血清5 μL，反應底物為6.99 μmol/L BTCh 應用液，抑制劑為10 μL BW284C51，其余步驟、條件及計算與本研究優化的羥胺三氯化鐵法測定AChE 酶活性實驗方案一致。

1.2.3 微孔板羥胺三氯化鐵法測定人血清標本中BChE 酶活性做預實驗以確定最佳稀釋倍數。稀釋倍數分別設為0.2、1.67、5、16.7、50。分別取5 μL不同稀釋倍數的人血清到微孔板。實驗結果中，稀釋倍數為0.2、1.67、5 的血清會產生肉眼可見的沉淀，稀釋倍數為50 倍的血清無法測出BChE 值。故本實驗取用稀釋16.7倍的血清。所用反應底物為6.99 μmol/L BTCh應用液。

設立標準孔、對照孔、樣品孔。對照孔和樣品孔分別加入5 μL稀釋后血清(稀釋16.7倍)，2 μL抑制劑BW284C51，PBS 溶液補足到20 μL。37 ℃預熱10 min。對照孔加入80 μL 堿性羥胺溶液和30 μL 應用液，樣品孔只加30 μL 應用液，37 ℃保溫箱孵育30 min。標準孔中分別加入0、4、8、12、16、20 μL 應用液，PBS溶液補足至40 μL(標準孔無需加熱)。樣品孔和標準孔加80 μL 堿性羥胺溶液振蕩3 min。所有孔中加40 μL 的1+2 HCl 溶液振蕩2 min，之后加入40 μL FeCl3溶液，使用全波長酶標儀(Thermo Multiskan GO，Thermo Scientific)測定吸光度值，測定波長為520 nm。利用標準曲線計算樣品的BChE 酶活性。

1.2.4 改良Ellman 法測定人血清標本中BChE 酶活性取5 μL 稀釋后的血清(稀釋倍數為300 倍)，80 μL Na2HPO4，10 μL DTNB，2 μL BW284C51，蒸餾水補足至150 μL，室溫避光放置30 min，加10 μL濃度為12.5 mmol/L BTCh，40 μL雙蒸水，412 nm酶標儀測定吸光度值，吸光度測定間隔2 min，時長10 min，ΔA/min與BChE成正比。

1.2.5 優化后方法的準確性及可靠性驗證為了驗證優化后測定方法的準確性和可靠性，參照羥胺三氯化鐵法(WS/T66-1996)的規范要求，依次對優化后測定方法的最低檢測濃度(檢測限)、線性范圍及變異系數進行了測定。

1.3 統計學方法

使用SPSS 22 進行數據統計分析，計量資料采用平均數±標準差(xˉ±s)或中位數±四分位間距(M±Q)進行描述。對于符合雙變量正態分布的數據，用Pearson積差相關系數r 表示相關性檢驗結果。對于不符合雙變量正態分布的數據，采用Spearman 等級相關系數rs表示。使用R語言作圖。雙側檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 羥胺三氯化鐵法測定人血清中AChE酶活性的靈敏度

羥胺三氯化鐵法測定人血清標本中AChE 酶活性的實驗結果如圖1 所示。結果表明，在羥胺三氯化鐵法體系中，加入一定劑量的iso-OMPA 后，血清體積與AChE 含量測定值之間并沒有表現出正相關關系。同樣，在微孔板體系中，加入一定劑量的iso-OMPA后，血清體積與AChE 含量測定值之間也沒有表現出正相關關系。這一結果給人造成的一種假象是血清體積越大，酶的活性越低。根據筆者理解，這一結果或與血清體系中AChE 酶活性含量過低以及體系中其他干擾因素影響測定有關。這一結果提示我們，羥胺三氯化鐵法或不適用于人血清AChE酶活性的測定。

2.2 不同方法測定人血清標本中BChE酶活性

表2 所示為基于改良Ellman 法進行人血清BCHE酶活性測定時最佳稀釋倍數的確定。判定稀釋倍數是否理想的依據是橫向比較同一稀釋倍數時總ChEs酶活性(測定體系中不加BW284C51)和BChE酶活性(測定體系中加BW284C51)，如果兩者結果之間具有顯著性差異，視為結果理想。結果表明，當血清稀釋100 倍且測定體系中加入2 μL BW284C51時，BChE 酶活性的測定結果最為理想(表2)。

圖1 羥胺三氯化鐵法測定人血清標本中AChE酶活性時血清體積與測定結果的關系

表2 人血清BChE酶活性測定最佳稀釋倍數的確定(改良Ellman法)

表3 所示為使用羥胺三氯化鐵法和微孔板羥胺三氯化鐵法測定同一批人血清標本中BChE 酶活性的結果比較。結果表明，兩種方法均可有效測定血清標本中BChE 酶活性，測定結果之間存在正相關關系(rs=0.653，P＜0.01)。

表3 使用不同方法測定同一批人血清標本中BChE酶活性的結果比較

2.3 不同方法測定人血清標本中BChE酶活性的相關性分析

表4所示為不同方法測定人血清標本中BChE的相關性分析。結果表明，羥胺三氯化鐵法、微孔板羥胺三氯化鐵法與改良Ellman法測定結果之間均存在正相關關系(P＜0.01)；微孔板羥胺三氯化鐵法與羥胺三氯化鐵法測定結果之間也存在正相關關系(P＜0.01)。以上結果提示，羥胺三氯化鐵法與微孔板羥胺三氯化鐵法測定結果均具有較高的可靠性。

2.4 優化后方法的準確性及可靠性

表5 所示為優化前后方法的準確性及可靠性分析。結果表明，與羥胺三氯化鐵法(WS/T66-1996)方法相比，微孔板羥胺三氯化鐵法的準確性及可靠性略佳，主要體現在最低檢測濃度及變異系數上。

表4 不同方法測定人血清標本中BChE的相關性分析

表5 優化前后方法的準確性及可靠性相關數據

3 討 論

目前的研究中，文獻報道的全血膽堿酯酶活性的分光光度測定方法往往不區分是何種膽堿酯酶，也沒有加抑制劑的概念[9]。一些研究雖加入抑制劑，卻是用一種抑制劑同時測定AChE與BChE。因兩種膽堿酯酶的生理活性不同，BChE與AChE的反應底物結合能力，BChE 水解BTCh 的速度大于ATCh。所以筆者認為，從定量測定AChE與BChE酶活性的角度考慮，應該加入相應的抑制劑，對酶活性分別檢測。具體地說， 測定BChE 加入AChE 的特異性抑制劑BW284C51，測定AChE 加入BChE 的特異性抑制劑iso-OMPA[10-11]。

在本研究中，加入iso-OMPA 的羥胺三氯化鐵法不適宜測定AChE，可能原因是人體血清中AChE 較BChE 含量甚微，后者大約是前者的10 倍，而該法靈敏度較低。另外加入iso-OMPA 后，底物抑制現象明顯[12]，據此推測加入iso-OMPA的羥胺三氯化鐵法測定人體血清AChE 效果差。用羥胺三氯化鐵法測定BChE，因人體血清BChE 含量豐富，且底物濃度增加時，BCHE 酶活性變化不明顯。所以用優化的羥胺三氯化鐵法測BChE較理想。

如前所述，優化的羥胺三氯化鐵法的局限性主要包括不適合通量測定，需在20 min內完成比色，容易產生沉淀。優化后的微孔板羥胺三氯化鐵法可以有效解決上述問題，表現出一定的方法學優勢(表6)。

表6 不同方法測定人血清中BChE酶活性結果比較

總之，微孔板羥胺三氯化鐵法是一種通量較高、經濟性較好的測定人血清標本中BChE 酶活性的方法，有一定的應用前景。