低水平鉛暴露損傷小鼠糖耐量及視網膜血管滲透性促進糖尿病視網膜病變發生

王曉會，肖 琛，趙和平，吳 賽，夏 冬，柳懷湘，劉潔儀，趙志強，何 云*

(中山大學公共衛生學院，廣州市環境污染與健康風險評價重點實驗室，廣東 廣州 510080)

鉛是自然界、工業及生活環境中容易接觸到的一種有毒重金屬。孕婦、兒童等是鉛暴露與吸收的高危人群。近年，大量研究表明鉛暴露并沒有安全閾值[1]，長期鉛暴露具有心血管毒性[2]。視網膜血管是反映心血管毒物毒性的良好窗口，視網膜血管內皮細胞、周細胞以及其間的緊密連接等構成了血-視網膜屏障，維持視網膜微環境穩態。糖尿病視網膜病變是糖尿病的一種常見微血管并發癥，成人失明的首要原因。血糖調節紊亂，糖耐量損害以及化學污染物等是促進糖尿病視網膜病變發生的風險因子。人群研究提示，糖尿病人群存在鉛暴露水平升高現象[3]，并且在職業性鉛暴露人群中發現血清中血管生成因子水平升高[4]。本課題組之前的研究提示，醋酸鉛暴露可以在小鼠體內破壞血腦屏障，體外內皮細胞暴露于鉛，緊密連接蛋白2(zona occludens protein-2)、閉合蛋白(occludin)與密封蛋白(claudin-5)等緊密連接相關分子表達水平顯著下降[5]。在我國，盡管鉛污染的關注與控制水平不斷加強，但持續性低水平鉛暴露仍是兒童等高危人群健康危險因子。因此，本研究建立了低劑量鉛暴露C57BL/6J小鼠模型，探討從孕期開始到子代成年早期與中期持續性的低水平鉛暴露對于小鼠糖耐量及視網膜血管通透性的影響，研究結果有助于解釋鉛暴露與糖尿病視網膜血管病變的關系及其機制，防治糖尿病視網膜病變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗所用48只SPF 級C57BL6J小鼠購于山東省實驗動物中心，許可證號SCXK(魯)20140007。本動物研究計劃獲得中山大學公共衛生學院動物倫理委員會審批(批準號2018-011)。36 只雌性小鼠和12 只雄性小鼠，于6周齡時購入，并在屏障環境中飼養檢疫適應1周。小鼠鉛染毒暴露的分組設計如圖1 所示。用去離子水分別配制含0、10、100、500 mg/L醋酸鉛的飲用水，7 周齡小鼠隨機分為4 組，每組均為9 只雌鼠和3只雄鼠，采用容積為250 mL 小鼠飲水瓶供水，每日定時更換，保持每籠小鼠飲水量一致。8 周齡時，將同組雌雄鼠按3∶1的比例隨機合籠。每日檢查雌鼠有無陰道栓，一旦確認懷孕，分籠喂養，并記為孕0.5天。仔鼠于斷奶后在其母鼠暴露水平下繼續給予醋酸鉛飲用水。每個醋酸鉛暴露劑量水平，子代小鼠成長到8周齡時分為8周組與20周組，每組12只，均雌雄各半。8 周組在此時收集樣品，利用石墨爐火焰原子吸收法檢測血鉛，小鼠腹腔葡萄糖耐量實驗檢測糖耐量水平，眼底靜脈熒光造影與小動物視網膜眼底成像技術檢測眼底血管滲透性以及實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測視網膜血管緊密連接相關分子轉錄水平改變；20周組繼續用醋酸鉛飲用水喂養至20周齡收取樣品檢測。

圖1 小鼠鉛染毒暴露的分組設計

1.2 主要試劑

FITC-Dextran，相對分子質量為70 000，三水合乙酸鉛，購于美國Sigma公司；EDTA抗凝采血管購于美國BD 公司；氯仿、葡萄糖、Tris-HCL、無水乙醇、戊巴比妥鈉、優級純硝酸、異丙醇購于廣州化學；mRNA 引物購于廣州天一輝遠公司；逆轉錄試劑盒購于日本TaKaRa 公司；羥丙基甲基纖維素購于沈陽興齊眼藥公司；SYBR Premix TaqTM試劑盒購于日本TOYOBO公司；Trizol購于美國Life公司；托吡卡胺購于參天制藥公司；血糖試紙購于北京怡成公司。

1.3 石墨爐原子吸收光譜法檢測血鉛水平

首先配制鉛標準溶液，使用5%硝酸稀釋，得到鉛標準梯度濃度為0、5、10、25、50 μg/L。每只小鼠取50 μL 的肝素抗凝血，加入5%的硝酸950 μL，振蕩混勻，室溫下放置15 min 后，15 000 r/min 離心10 min。最后，取鉛標準梯度和800 μL 處理血樣用石墨爐原子吸收光譜法測定，獲得鉛標準曲線并計算樣本血鉛含量。

1.4 腹腔葡萄糖耐量試驗檢測糖耐量

采用怡成5D-1 血糖儀及專用試紙檢測小鼠尾靜脈血糖水平。收樣前3 d，對8 周組和20 周組小鼠實施糖耐量試驗，提前禁食12 h，稱重并檢測空腹血糖水平后小鼠適應30 min；然后，小鼠按2 g/kg腹腔注射葡萄糖生理鹽水溶液，分別在15、30、60、90 和120 min 后檢測血糖水平，計算血糖隨時間變化的曲線下面積積分(aera under curve，AUC)。

1.5 小鼠眼底視網膜血管熒光造影檢測視網膜血管滲透性

使用2%的戊巴比妥鈉預先麻醉小鼠，使用托吡卡胺滴眼液促進并維持瞳孔開放，羥丙基甲基纖維素保持小鼠眼睛眼睛濕潤。經眼后內眥靜脈叢[6]按0.25 g/kg 注入熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖(FITC-Dextran)后，立即用小動物視網膜活體成像系統拍攝視網膜血管網明場及熒光視野的視頻及照片。

1.6 實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢測緊密連接相關分子蛋白轉錄

緊密連接是血視網膜屏障的主要組成部分，因此我們檢測了緊密連接蛋白-1(Zona occludens protein-1，ZO-1)，Occludin與Claudin-1、3、5等緊密連接相關分子，并以GAPDH 為內參。剝離小鼠視網膜，在預冷的PBS 中漂洗，使用Trizol 抽提視網膜總RNA，再逆轉錄成cDNA，各基因的引物序列如表1所示。各基因轉錄水平按照SYBR Premix TaqTM試劑盒說明書進行qPCR反應體系配制，最后使用2-ΔΔCT法對其相對定量并進行組間比較。

表1 qPCR引物序列表

1.7 統計分析

采用SPSS 20.0 統計學分析，計量數據采用xˉ±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗，3組或以上樣本采用單因素方差分析(ANOVA)，線性回歸分析分析醋酸鉛外暴露與血鉛水平的關系，以a=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 不同醋酸鉛暴露水平對小鼠血鉛水平的影響

醋酸鉛染毒8 和20 周組小鼠的血鉛水平如圖2 所示，隨著飲水中醋酸鉛濃度的升高，小鼠血鉛濃度與對照小鼠相比顯著升高，存在劑量反應關系(r8周組=0.887，r20周組=0.972，P 均＜0.05)。值得注意的是，在100 mg/L 劑量以下，染毒8 周組小鼠的血鉛濃度高于染毒20 周組(P＜0.05)；在500 mg/L 劑量下，染毒8 周組小鼠的血鉛濃度低于染毒20周組(P＜0.01)。

圖2 不同濃度醋酸鉛染毒8和20周的小鼠血鉛濃度的變化

2.2 不同醋酸鉛暴露水平對小鼠糖耐量的影響

染毒8和20周小鼠空腹腹腔注射葡萄糖后，血糖變化及其血糖隨時間變化曲線下面積積分AUC 比較，如圖3 所示，鉛暴露小鼠2 h 血糖值高于對照組小鼠。鉛暴露小鼠AUC 高于對照組小鼠(P＜0.05 或P＜0.01)。在染毒8 周組，小鼠血糖及AUC 在10 mg/L 醋酸鉛染毒時與對照組差異最明顯，而在染毒20周組小鼠在100 mg/L醋酸鉛染毒時與對照組差異最明顯。

圖3 不同濃度醋酸鉛染毒8和20周的小鼠糖耐量的變化

2.3 不同醋酸鉛暴露水平對小鼠視網膜血管滲透性的影響

相對分子質量為70 000的FITC-Dextran與血清白蛋白相對分子質量相近，已應用于評估血管滲漏性。如圖4A～D所示，在染毒8周組，小鼠暫未出現明顯視網膜血管滲漏病灶。圖4E～H 所示，在染毒20 周組，100 與500 mg/L 醋酸鉛染毒劑量下，小鼠視網膜出現明顯的滲漏病灶。

圖4 不同濃度醋酸鉛染毒8和20周的小鼠視網膜血管滲漏情況

2.4 不同醋酸鉛暴露水平對小鼠視網膜血管內皮細胞間緊密連接的影響

緊密連接是血視網膜屏障的主要組成部分，緊密連接組成組分分子的表達改變會嚴重影響緊密連接功能，進而改變血管滲透性。因此我們檢測了ZO-1，Occludin與Claudin-1、3、5等緊密連接相關分子，采用qPCR 技術檢測了視網膜組織中ZO-1，Occludin 和Claudin-1、3、5等蛋白分子的mRNA轉錄水平，結果如圖5 所示。在染毒8 周組，隨著醋酸鉛濃度升高，ZO-1 與Claudin-1、3、5 蛋白分子轉錄水平呈現先增后減的趨勢，而Occludin 蛋白分子的mRNA 轉錄水平受到抑制，與對照組小鼠相比差異顯著(P＜0.05 或P＜0.01)。在染毒20周組，隨著醋酸鉛濃度的升高，ZO-1，Occludin 和Claudin-1、3、5 蛋白分子的mRNA 轉錄被廣泛抑制，與對照組小鼠相比差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討 論

鉛作為一種化學污染物，其顯著毒性在神經系統與血液系統，近年來，慢性鉛中毒引起的代謝毒性與心血管毒性受到關注[2-3，7-8]。鉛經過生活飲用水、空氣、食品和工業品等介質進入人體，飲用水是主要途徑之一。我國多次出現工廠違規排污導致地表水受含鉛等重金屬污染事件[9]；另一方面，供水管道內易發生鉛溶出導致家庭飲用水等受到鉛污染[10-11]。胎兒和兒童是環境鉛暴露高危人群[8，12]。早期研究提示，100 mg/L鉛暴露即可導致視覺功能受損及視網膜結構損害[13-14]。500 mg/L 醋酸鉛成年期暴露ZDF 肥胖大鼠空腹血糖出現升高，糖耐量受損[15]。本研究結果顯示，幼年期或成年期小鼠暴露于500 mg/L醋酸鉛均可破壞小鼠血腦屏障，導致腦組織滲透性顯著升高。體外研究提示，腦內皮細胞暴露于鉛，會導致緊密連接相關蛋白分子ZO-2，Occludin 與Claudin-5 表達水平顯著下降[5]。近年體內研究提示，成年期SD大鼠暴露于200 mg/L醋酸鉛可能導致血視網膜屏障被破壞，外源示蹤劑Evans Blue 滲漏增加，其Occludin 與Claudin-5等緊密連接蛋白表達受到抑制[16]。而幼年期鉛暴露對于視網膜血管與糖代謝的影響卻缺乏證據，因此，研究幼年期飲水鉛暴露更具有重要公共衛生意義。

圖5 不同濃度醋酸鉛染毒8周和20周的小鼠視網膜緊密連接相關蛋白分子的mRNA轉錄水平的變化

血鉛能較好地反映近期鉛暴露水平，染毒8 周組反映了幼年期小鼠對鉛暴露更敏感，吸收度高而排泄能力不足。進入成年期后，小鼠對鉛暴露敏感度下降而排泄能力更強。結果顯示，在0～100 mg/L范圍內成年期小鼠血鉛更低，而較高的500 mg/L暴露水平呈現了逆轉，反映了鉛排泄的失代償。

糖尿病視網膜病變是糖尿病的主要并發癥類型。高血糖，糖耐量損傷及化學污染物等是其主要危險因素[7，17]。整體上，從染毒8 周與20 周兩組小鼠對照水平比較提示，成年小鼠空腹注射葡萄糖后血糖及AUC更低，AUC越低，對血糖的調節能力越強。小鼠在幼年期，糖耐量試驗中與對照組相比，醋酸鉛染毒小鼠血糖更高，AUC更高，反映了血糖調節能力更低。在染毒8 周組，小鼠血糖調節能力在10 mg/L 醋酸鉛濃度下改變最明顯，其并不簡單的表現為線性劑量反應關系。進入成年期后，小鼠本身的糖耐量能力是增強的，在0～100 mg/L 劑量范圍內呈現劑量-反應關系，小鼠血糖調節能力在100 mg/L醋酸鉛濃度下改變最明顯。總體上，鉛暴露會一定程度上破壞小鼠的血糖調節能力。幼年期極低劑量的鉛暴露即可導致糖耐量的損害。進入成年期，鉛暴露仍然會導致血糖調節能力下降，但其對鉛暴露的敏感劑量提高，但其損害程度相較幼年期無顯著地差異。這提示，幼年期極低劑量的鉛暴露對機體糖代謝的損害更為危險。也再次提示鉛暴露沒有“安全劑量”。鉛暴露導致的血糖調節能力下降，間接可能促進糖尿病視網膜病變的發生。

本研究進一步直接觀察了鉛暴露對于視網膜血管滲透性的影響。在染毒8 周組幼年期階段，緊密連接相關分子ZO-1，Occludin 與Claudin-1、3、5 等在鉛暴露的刺激下，呈現轉錄先增加后減少的表現，體現了血管應對外界刺激的一種應激代償反應，血管間的緊密連接并未失代償，血視網膜屏障保持其功能完整良好。在染毒20周組，進一步在成年期鉛暴露導致了緊密連接的破壞，功能失代償，血管出現滲漏表現。提示，鉛暴露可直接損傷血視網膜屏障，并引起滲漏，其部分機制可能涉及緊密連接的破壞。這些結果與先前在成年期SD大鼠的結果相印證[16]，這表明鉛暴露對于血視網膜屏障的破壞是進展性的，幼年期雖然已經存在分子水平變化，但并不敏感。持續的鉛暴露，在成年期后會直接損害血視網膜屏障，導致糖尿病視網膜血管病變等疾病的發生。

綜上所述，在本次研究中我們發現極低的鉛暴露劑量仍然存在健康風險，幼年期的鉛暴露在極低劑量條件下就能導致小鼠血糖調節能力下降。長期鉛暴露可以直接誘導視網膜血管損傷，其機制可能涉及緊密連接的破壞。