基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討國醫(yī)大師張磊運脾湯治療高脂血癥的分子機制＊

林遠茂，施榮聰，黃寶特，徐世安，孫玉信，姜 楓

（1. 廣西中醫(yī)藥大學研究生院 南寧 530011；2. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 南寧 530011；3. 河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 鄭州 450003）

高脂血癥（Hyperlipidemia）是人體脂質(zhì)代謝的異常的一種表現(xiàn)，其特征在于總膽固醇、甘油三酸酯和低密度脂蛋白膽固醇的升高，或伴隨著高密度脂蛋白膽固醇的循環(huán)水平降低[1]。高脂血癥相關(guān)的脂質(zhì)疾病被認為是動脈粥樣硬化性心血管疾病的主要原因，高脂血癥已被列為導致冠心病患病率和嚴重性的最大危險因素之一[2]。隨著生活習慣的改變和膳食營養(yǎng)的提高，人體攝入高脂肪和高糖分含量的食物越來越多，高脂血癥患者數(shù)量逐年上升，高脂血癥已經(jīng)成為危害全球健康的危險因素[3]。目前，國內(nèi)外對中草藥降低血漿膽固醇水平的作用做了充分研究，證實中草藥在降低膽固醇水平方面的有效性和安全性[4]。古代中醫(yī)書籍中，可見“膏粱”“高脂”等關(guān)于現(xiàn)代高脂血癥的相關(guān)記載；中醫(yī)認為，高脂血癥常伴有“血瘀”“痰濁”“濕阻”等特征，在中醫(yī)理論的指導下，中醫(yī)藥在臨床上已廣泛應(yīng)用于高脂血癥及其相關(guān)并發(fā)癥的治療，具有療效明顯、毒副作用小的優(yōu)點[5]。

運脾湯是國醫(yī)大師張磊教授“臨證八法”中“運通法”的代表方，在“腑以通為順”“脾以運為健”的基本思想上立法組方，其主要藥物組成有檳榔、炒牽牛子、豆蔻、茯苓、炒麥芽、炒神曲、炒山楂等藥物，具有運脾化積，消食導滯等功效，臨床多用于治療飲食失節(jié)、脾濕過盛，運化失常所致的諸多病癥[6]。本研究通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學等數(shù)據(jù)挖掘和分析的方法，探討“中藥有效成分-靶點-疾病”之間的復雜作用關(guān)系，從而挖掘國醫(yī)大師張磊運用運脾湯治療高脂血癥的現(xiàn)代藥理作用機制，為運脾湯治療高脂血癥的進一步探討提供參考。

1 資料與方法

1.1 運脾湯有效化學成分的收集和篩選及靶點預(yù)測

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php），將同時滿足口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的化合物作為納入標準[7]，得到山楂、麥芽、萊菔子、陳皮、半夏、茯苓、連翹、檳榔、牽牛子、甘草的潛在活性化合物成分及相關(guān)靶點；查閱相關(guān)文獻對神曲的潛在活性成分進行補充。Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），對已篩選出的部分潛在有效化學成分進行靶點預(yù)測補充，在數(shù)據(jù)庫中不能預(yù)測到作用靶點的成分則剔除。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）篩選人源靶點并進行基因注釋。

1.2 高脂血癥疾病靶點的收集

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/）這兩個數(shù)據(jù)庫中，以“Hyperlipidemia”為檢索詞檢索，綜合獲取的數(shù)據(jù)，去除重復值，取并集，得到高脂血癥疾病的相關(guān)疾病基因。

1.3 預(yù)測運脾湯治療高脂血癥的相關(guān)靶點

運用Venny 平臺（2.1，http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將運脾湯中有效化學成分所對應(yīng)的相關(guān)靶點與高脂血癥的疾病靶點取交集，得到運脾湯治療高脂血癥的相關(guān)靶點。

1.4 運脾湯治療高脂血癥相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖與分析

將運脾湯的靶點基因和高脂血癥疾病基因取的交集，導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建其蛋白互相作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，分析運脾湯治療高脂血癥相關(guān)靶點之間的相互作用關(guān)系。使用Cytoscape（3.6.0）軟件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化處理，并通過Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓撲參數(shù)。

1.5 化合物與靶點分子對接

iGEMDOCK 是通用進化方法用于計算相對于靶蛋白活性位點的配體構(gòu)象和方向的軟件。可以用于初步篩選和精度對接。其結(jié)果以能量的高低去判斷靶蛋白與配體的結(jié)合程度，通常靶蛋白與化合物配體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時的能量越低，說明發(fā)生作用的可能性越大。根據(jù)1.4 中通過計算拓撲學參數(shù)得到的degree值排名前10類的靶蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）檢索，并保持其pdb 格式文件。根據(jù)1.4中度值（degree）≥5 的化合物在TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取其化合物配體mol2格式文件。

1.6 生物信息學分析

運用DAVID 生物信息學資源平臺6.8（https://david.ncifcrf.gov/）做交集基因的GO 富集分析與KEGG富集分析。限定研究物種為人類，選擇Gene Ontology下的分子功能（Molecular Function）、生物過程（Biological Process）和細胞組成（Cellular Component）3個部分進行GO 富集分析，選擇Pathway 分析中KEGG Pathway，設(shè)定顯著性為P＜0.05，進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能注釋與信號轉(zhuǎn)導通路。

1.7 構(gòu)建“中藥材-有效化學成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)

將所有分析結(jié)果整理并導入Cytoscape（3.6.0）軟件，處理得到“中藥材-有效化學成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 運脾湯有效化合物和相關(guān)靶點

在運脾湯中，去除雞內(nèi)金和鱉甲兩味未檢索到對應(yīng)化合物信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為標準，篩選得到山楂有6 種有效化合物及其對應(yīng)的人源靶點144 個、麥芽18 種對應(yīng)56 個、萊菔子3種對應(yīng)4個、陳皮5種對應(yīng)41個、半夏13種對應(yīng)73 個、茯苓15 種對應(yīng)15 個、連翹23 種對應(yīng)219 個、檳榔8 種對應(yīng)13 個、牽牛子22 種對應(yīng)111 個、甘草92種對應(yīng)720 個，神曲8 種對應(yīng)146 個，去除重復化合物及重復靶點，運脾湯共計128 種有效成分對應(yīng)人源靶點142個。

2.2 高脂血癥疾病靶點數(shù)據(jù)庫

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，初步篩選獲得1164 個與高脂血癥相關(guān)的候選基因，根據(jù)“Relevance score”度值，選取相關(guān)度較高的前600 個結(jié)果，在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中檢索，發(fā)現(xiàn)231 個相關(guān)基因，經(jīng)合并數(shù)據(jù)庫查詢，去除重復共篩選出718 個與高脂血癥高度相關(guān)性靶點。

2.3 運脾湯治療高脂血癥的相關(guān)靶點和活性化學成分

通過Venny平臺分析得到運脾湯中干預(yù)高脂血癥的靶點40 個（圖1），其中共涉及128 個有效化學成分（表1）。在運脾湯所有有效化學成分中，與關(guān)鍵靶點關(guān)系密切的前10的有效化學成分的結(jié)構(gòu)（圖2）。

表1 運脾湯有效化學成分詳細信息

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 運脾湯作用靶點與高脂血癥靶點韋恩圖

2.4 運脾湯治療高脂血癥相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖與分析

將運脾湯干預(yù)高脂血癥的40個靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)相互作用分析，設(shè)置可信度為0.4，得到靶點之間相互作用關(guān)系。導入Cytoscape（3.6.0）軟件進行可視化（圖3）。在Cytoscape（3.6.0）軟件中，通過Network Analyzer 功能分析網(wǎng)絡(luò)中的拓撲參數(shù)，根據(jù)degree結(jié)果顯示，胰島素（INS）、白介素6（IL6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、過氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPARG）、一氧化氮合酶（NOS3）、表皮生長因子受體（EGFR）、載脂蛋白B（APOB）、細胞間粘附分子1（ICAM1）、CAV1和雌激素受體（ESR1）為運脾湯干預(yù)高脂血癥的核心靶點；且運脾湯中干預(yù)高脂血癥的活 性 化 學 成 分naringenin、quercetin、kaempferol 和luteolin主要來源于連翹、山楂、神曲、陳皮、甘草。

表2 運脾湯干預(yù)高脂血癥蛋白互作拓撲學分析（按度值排序取前10個）

2.5 分子對接結(jié)果

iGEMDOCK 分子對接結(jié)果將運脾湯干預(yù)高脂血癥的10 個關(guān)鍵靶點與運脾湯中經(jīng)拓撲學參數(shù)計算的22個關(guān)鍵化合物進行分子對接，靶蛋白與化合物配體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低發(fā)生的作用可能性越大[8]，分析結(jié)合力具體參數(shù)（圖4）和具體分子對接參數(shù)（表3），其中結(jié)合性最強的是NOS3與nobiletin（圖5）。

2.6 運脾湯主要活性成分對高脂血癥作用靶點的生物信息學分析結(jié)果

圖2 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前10的有效化學成分結(jié)構(gòu)

圖3 運脾湯干預(yù)高脂血癥相關(guān)靶點間蛋白互作關(guān)系

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能富集分析，結(jié)果得到48 個GO 功能富集條目，其中涉及生物過程（BP）的相關(guān)條目最多，共計30 條，主要包括一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、上皮細胞增殖的正調(diào)控、肽基酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、蛋白激酶B 信號轉(zhuǎn)導的正調(diào)控和凋亡過程的負調(diào)控等方面；其中有7 條細胞組成（CC），主要包括膜筏、受體復合體、基底外側(cè)質(zhì)膜、質(zhì)膜的外側(cè)和內(nèi)體膜等方面；并有11 條分子功能（MF），主要包括類固醇激素受體活性、酶結(jié)合和蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性等方面（圖6）。

KEGG 通路富集分析得到48 條信號通路，其中按Gene Ratio 值選取25 條富集結(jié)果最相關(guān)的信號通路，導入RSudio 軟件制作高級氣泡圖進行分析（圖7、表3）。包括HIF-1 信號通路、胰島素信號通路、PI3KAkt 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、Fox O信號通路、TNF信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化和卵巢類固醇生成等通路。分析靶點與相關(guān)性較大的通路HIF-1 信號通路的作用關(guān)系（圖8），紅色為表達促進作用。

2.7 構(gòu)建“中藥材-有效化學成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)

圖4 運脾湯主要化學成分與關(guān)鍵靶點對接結(jié)果

圖5 NOS3與nobiletin

根據(jù)上述結(jié)果，繪制網(wǎng)絡(luò)藥理學分析運脾湯干預(yù)高脂血癥的各元素綜合網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree 調(diào)節(jié)節(jié)點大小，使核心靶點和主要有效化學成分在網(wǎng)絡(luò)圖中突出表現(xiàn)（圖9）。網(wǎng)絡(luò)圖中共包括249 個節(jié)點、680 條邊；圖中左側(cè)的模塊分別為運脾湯各組成中藥及其主要化學成分，其中紅色六邊形節(jié)點為中藥，藍色菱形為其化學成分；右側(cè)的模塊為綠色圓形為40個關(guān)鍵靶點，最右側(cè)外方的紫色三角形模塊為KEGG 分析排名前10的信號通路。

3 討論

高脂血癥是由血脂代謝異常引起的較為常見的代謝性疾病，亦是目前公認的動脈粥樣硬化性心血管疾病的高危誘導因素。生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的改變，越來越多的人存在血脂異常癥狀。長期高水平的血脂容易誘冠心病、胰腺炎和高血壓等疾病。傳統(tǒng)的活血化瘀型中藥針對伴有“血瘀”“痰濁”“濕阻”等特征的高脂血癥，具有“活血化瘀、滋陰化濁”的顯著優(yōu)勢。國醫(yī)大師張磊教授以運脾“湯運脾化積，消食導滯”治療臨床上諸多脾胃運化失司導致的病癥，亦見于高脂血癥的治療，體現(xiàn)了中醫(yī)學異病同治的辨證論治思想。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，初步挖掘、分析運脾湯治療高脂血癥的可能作用機制和物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究通過系統(tǒng)藥理學的方法分析了運脾湯中11 味中草藥的有效化學成分，及各化學成分與靶點的關(guān)系，128 個有效化學成分主要是木脂素和黃酮等幾類化學物質(zhì)。大部分化合物與關(guān)鍵靶點之間的相互作用經(jīng)過分子對接驗證，都具有較強的結(jié)合能力。通過對化合物與靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析，發(fā)現(xiàn)木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）和川陳皮素（nobiletin）在網(wǎng)絡(luò)中有較高的度值和中心性，說明這些化合物在網(wǎng)絡(luò)中具有較重要的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，木犀草素可以通過與NPC1L1 結(jié)合直接抑制NPC1L1 的表達，發(fā)揮降低血液膽固醇的作用；并且抑制促炎性細胞因子TNF-α、IL-6的分泌，通過作用于TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)。木犀草素通過減少降低巨噬細胞中AMPKSIRT1信號傳導的機制抑制LDL 受體缺陷小鼠的動脈粥樣硬化[11]。槲皮素單獨使用或作為鐵絡(luò)合物使用，可以防止脂肪堆積，并降低血糖、血脂，減輕肝脂肪變性和氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。山奈酚可以通過多種機制抑制蛋白激酶B（AKT）和SREBP-1 的活性，并對激活PPAR α 和PPAR δ，同時促進與脂肪酸氧化和肝細胞攝取脂肪有關(guān)基因的表達，從而降低血液中甘油三酯的水平[13]。柚皮素和川陳皮素屬于柑桔類黃酮，柚皮素通過誘導肝脂肪酸（FA）的氧化和減弱FA 的合成，預(yù)防肝組織脂肪樣變性、肝臟中極低密度脂蛋白（VLDL）的生成和高脂血癥的形成，并減輕胰島素抵抗、緩解脂肪組織擴張和炎癥[14]。

表3 運脾湯作用高脂血癥靶點的部分富集通路

圖6 運脾湯對高脂血癥作用靶點的GO功能富集分析柱狀圖

在靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析參數(shù)顯示，INS、IL6、VEGFA、PPARG、NOS3、EGFR、APOB 和ESR1 等靶點在網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)較高的連通特性，其在運脾湯治療高脂血癥的過程可能發(fā)揮較重要作用。分子對接結(jié)果顯示，木犀草素、槲皮素、山奈酚、柚皮素、川陳皮素與NOS3、PPARG、APOB、ESR1、VEGFA 均有較強的結(jié)合活性，因此運脾湯可能是通過作用這些靶點對高脂血癥發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA 具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡并調(diào)節(jié)血管通透性的作用[15]，NOS3 可以產(chǎn)生一氧化氮（NO），其通過cGMP 介導的信號轉(zhuǎn)導途徑參與使血管平滑肌松弛，并介導冠狀血管中VEGF 的血管生成[16]。PPARG是PPARs家族中最具脂肪細胞專一性的因子，是脂肪細胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[17]，可以通過結(jié)合過降血脂藥和脂肪酸的核受體，調(diào)控過氧化物酶體脂肪酸β 的氧化途徑，促進滋養(yǎng)細胞中中性脂質(zhì)的積累以及游離脂肪酸的攝取，也增加了脂肪分化相關(guān)蛋白與脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白的合成[18]。ESR1 在調(diào)節(jié)脂肪組織中的VEGFA 介導的血管生成具有重要作用[19]，可抑制血管平滑肌增殖和遷移，保護血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能，預(yù)防動脈脂質(zhì)和復合糖類的形成[20]。

圖7 運脾湯對高脂血癥作用靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

圖8 運脾湯中HIF-1信號通路潛在靶基因的KEGG通路分析

圖9 運脾湯干預(yù)高脂血癥“中藥材-有效化學成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)圖

運脾湯治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點GO 功能富集顯示，運脾湯可能通過藥物反應(yīng)、細胞內(nèi)外刺激、脂多糖反應(yīng)和反向調(diào)節(jié)凋亡等生物學過程來干預(yù)高脂血癥；這些靶點主要位于膜筏、基底外側(cè)質(zhì)膜、頂體膜、細胞表面等處；具有抗氧化活性和酶結(jié)合等分子功能。KEGG 結(jié)果分析，運脾湯干預(yù)高脂血癥的主要通過有HIF-1 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、胰島素信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路。HIF-1信號通路中的低氧誘導因子1（HIF-1），是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞在低氧環(huán)境下的反應(yīng)，在過氧化物酶體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[21]，HIF-1 通過激活肝組織中脂素lipin 1 的表達，從而導致活性氧的減少和防止肝脂質(zhì)沉積[22]。AGE-RAGE 信號通路的激活能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB、VCAM-1 和炎性因子的產(chǎn)生，誘導炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。是眾多糖脂代謝疾病如糖尿病、高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化等高度相關(guān)的靶點信號通路[24]。胰島素信號通路主要調(diào)節(jié)脂肪細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪分解，與胰島素抵抗密切相關(guān)[25]。研究發(fā)現(xiàn)[26]，高脂血癥在誘發(fā)動脈粥樣硬化的過程中，炎癥細胞因子，如VEGF 和TNF-α 會誘發(fā)血管血栓的形成，同時導致大量正常的細胞凋亡，加劇病情的發(fā)展。

綜上所述，運脾湯中的多個有效化學成分能同時作用于2 個以上的靶點，并對應(yīng)多條信號通路，在抗炎、氧化和誘導細胞凋亡等方面具有一定效果，體現(xiàn)了運脾湯從多靶點、多途徑干預(yù)高脂血癥的分子機制，主要作用為改善細胞代謝、調(diào)節(jié)血管活性和糖脂代謝等多個方面。并且對冠心病等心血管及糖尿病、胰島素拮抗等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病有著多重協(xié)同效應(yīng)。網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子生物學、生物信息學等學科，本著整體性和動態(tài)性的特點，倡導多靶點、多途徑的研究分析的思路與中醫(yī)治療的整體觀念、辨證論治指導思想相符，也是目前研究中藥作用機制較為全面的方法[27]。本研究預(yù)測了運脾湯干預(yù)高脂血癥的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制并挖掘潛在的作用靶點，為下一步深入實驗驗證奠定了理論基礎(chǔ)和方向。