代謝組學在臨床慢性腎病診斷中的應用及研究＊

蔡志鋼

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院 上海 201203）

慢性腎病（Chronic kidney disease，CKD）將導致腎功能逐漸喪失并誘導發展成終末期腎病，最終需要腎透析或腎移植進行治療。然而，CKD 早期階段（1-2期）幾乎沒有任何征兆或癥狀導致該疾病常常在疾病后期才被發現。臨床研究發現CKD 患者心血管疾病發病率和死亡率風險會隨著CKD 的進展而增加[1]，CKD患者心血管死亡率至少比普通人群高8-10倍，并且在過去幾十年中并未得到實質性改善[2]。此外，CKD 患者并發傳染病風險也大大增加。CKD 在全世界已經成為常見疾病，并且隨著老齡化增加以及肥胖和糖尿病患病率增加而發病率呈上升趨勢[3]。CKD 向終末期腎臟疾病（End stage renal disease，ESRD）進展中也增加對腎臟替代療法（腹膜透析，血液透析和血液濾過）和腎臟移植的需求，而這些治療方式大大增加醫療負擔。因此，CKD 早診斷、早干預、早治療成為亟需解決的問題。

高通量組學方法已經徹底改變了生物標志物篩選的局面，特別是代謝組學（Metabolomics）定性定量描述生物體內代謝物之間相互作用關系，與機體病理生理過程聯系起來，可以作為潛在生物標志物或干預治療靶點。在大規模流行病學研究中可采用高通量和高分辨率代謝組學分析技術研究特征明確人群的代謝表型篩選相關潛在生物標志物[4,5]。通過發現潛在生物標志物揭示潛在代謝途徑以深入了解疾病機制[6]。本文將從CKD 臨床診斷研究現狀、代謝組學在CKD中的應用、CKD相關代謝物等方面進行闡述。

1 CKD臨床診斷研究現狀

CKD 面臨的最大挑戰是發現新的臨床診斷指標或疾病分層指標進行早干預早治療。目前CKD 常規臨床評估是基于測量腎臟損害標志物（蛋白尿）和估計腎功能（估算腎小球濾過率，Estimated glomerular filtration rate，eGFR）。然而，eGFR 采用血清肌酐進行計算，肌酐可能受到非腎臟疾病進展過程影響（如肌肉質量或高齡）而造成計算誤差。同時，蛋白尿（白蛋白尿）的評估也會受到非腎臟疾病過程影響（如發熱、感染）。而且，蛋白尿可能在許多原發性腎臟疾病腎臟損傷得到緩解后仍長期存在，導致繼續采取不必要的治療[7]。以eGFR 為標準的CKD 誤診和以蛋白尿為標準腎損害錯誤評估的可能性非常高[8]，因此急需更好的腎功能評估指標以提高CKD 診斷準確性。血清胱抑素-C 的引入將改善肌酐變化引起的GFR 偏差，因為與肌酐相比，血清胱抑素-C水平對年齡、性別、特別是肌肉質量的依賴性較小。不過高劑量糖皮質激素會對其產生影響，所以使用糖皮質激素治療的患者應注意使用該方法[9]。甲狀腺疾病對血清胱抑素C 濃度也有GFR非依賴性影響[10,11]。由于血清胱抑素-C主要由肝臟合成，慢性和急性肝功能損傷對血清胱抑素-C 濃度也具有GFR 非依賴性影響[12]。因此，對這些人群進行GFR 評估時應當采用更綜合評估方式。基于血清胱抑素-C 的GFR 評估也不適合確定潛在腎臟疾病的具體類型和疾病進展程度。除了引入血清胱抑素-C 進行GFR 評估外，其他新型標志物如腎損傷分子-1（Kidney injury molecule 1，KIM-1）、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（Neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）和肝脂肪酸結合蛋白（Liver fatty acid-binding protein，L-FABP）在臨床中也進行了探索與應用，不過其應用性也存在一定局限性。例如，血清L-FABP 濃度可以反映腎小管損傷程度，但不能反饋導致腎小管損傷的病因信息[13,14]。尿液中KIM-1 濃度通常需要根據尿肌酐濃度進行歸一化計算[15]。但這些指標依然不能用于區分慢性腎病進展程度。目前一般采用腎臟組織活檢進行最終診斷，但組織活檢是一種有創型診斷方式，有時候會引發嚴重并發癥。因此，新的診斷及干預生物標志物亟需進一步開發，良好的生物標志物將有助于CKD 患者進行早期診斷，并確定最佳治療方案。

2 代謝組學在CKD臨床診斷中的應用

隨著代謝組學技術的發展及應用，已有臨床研究采用代謝組學技術篩選發現腎臟疾病新的潛在生物標志物。潛在標志物的篩選有利于對早期CKD 進展風險進行評估及分類[16,17]，針對不同類型患者進行早期干預以防止腎臟損害的發展。臨床中可采用隊列進行研究，因為隊列樣本研究一方面更能代表疾病人群，另一方面可以減少混雜因素的影響，從而有助于發現生物標志物[18]。Zhao 等[19]對2155 名受試者（包括1-5期CKD患者和健康對照組）采用非靶向代謝組學技術進行檢測分析，最終確定了5種代謝物（5-甲氧基色氨酸、刀豆胺基琥珀酸、乙酰肉堿、甲基巴豆酰肉堿、牛磺酸），其中5-甲氧基色氨酸（5-Methoxytryptophan，5-MTP）水平與腎臟疾病的臨床標志物密切相關（與eGFR 相關系數最高，為0.91），5-MTP 水平隨著CKD的進展而降低，其靈敏度和特異性分別為86.7%，99.7%。K?ttgen 等[20]利用不同中心隊列樣本進行代謝物檢測分析，其中54 個代謝物與eGFRcr（根據肌酐計算GFR）存在顯著相關，其中六種代謝物（C-甘露糖基色氨酸、假尿苷、N-乙酰丙氨酸、2,3,4-三羥基丁酸、肌醇和N-乙酰肌肽）與腎功能指標相關系數大于0.5。構建CKD 預測模型，發現單獨代謝物預測模型曲線下面積（AUC）為0.82（95%CI，0.77-0.86），單獨臨床風險指標預測模型AUC 為0.83（95% CI，0.79-0.87），將代謝物與臨床指標結合構建預測模型AUC 可提高至0.84（95%CI，0.80-0.88）。另一種研究策略可采用不同代謝組學技術對不同類型樣本進行潛在生物標志物篩選。目前，質譜和核磁共振是代謝組學重要的研究平臺。不同檢測平臺可針對不同種類代謝物進行檢測篩選，從而有利于潛在生物標志物的發現。Dai等[21]基于1H-NMR代謝組學方法對不同分期CKD患者（n=80）和健康對照組（n=28）的血清樣本進行代謝譜分析。結果顯示，CKD 不同分期中糖酵解產物（葡萄糖、乳酸）、氨基酸（纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸）等內源性代謝物出現變化。Rosalinde 等[22]采用1HNMR 技術對3-4 期CKD 患者及健康對照者血漿代謝譜進行分析，發現14種代謝物水平升高。除了已確定的尿毒癥毒素（包括對甲酚硫酸鹽）之外，還檢測到新型的尿毒癥保留溶質，如2-羥基異丁酸。Harold 等[23]采用LC-MS 代謝組學技術對400 例受試者（200 例腎功能不全進展期患者和200 例腎功能不全穩定期患者）進行血漿代謝譜檢測分析，其中有6 種代謝物（尿酸、葡糖醛酸、4-羥基扁桃酸、3-甲基己二酸/庚二酸、胞嘧啶和2，5-二羥苯乙酸）水平在進展期患者中升高，4種氨基酸類代謝物（蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和精氨酸）在進展期患者中水平降低。經過年齡、性別、并發癥等因子校正后，水平升高的6 個代謝物與基線eGFR 存在顯著負相關，而4 個氨基酸代謝物與基線eGFR 無相關性。Mischak 等[24]對49 名不同階段CKD患者采用LC-MS/MS技術分析尿液和血漿樣本代謝組變化。其中血漿中發現17種差異代謝物，尿液中發現13 種差異代謝物，而這些差異代謝物與eGFR 存在顯著相關。由此可見，采用大隊列樣本進行多個代謝組學平臺分析不同類型樣本將有利于對代謝物進行全面監測，也更有利于發現CKD 疾病發生發展的潛在生物標志物。

3 CKD潛在生物標志物

目前代謝組學研究已發現幾種代謝物與CKD 相關，且采用聯合應用比單一代謝物能更好的區分患者和健康個體[25]。根據臨床CKD 代謝組學研究整理代謝物列表（表1），這些研究為新生物標志物的發現和疾病診斷提供了新的視角[26,27]。

氨基酸及其代謝物：色氨酸是人體必需氨基酸，也是唯一含有吲哚結構的氨基酸。色氨酸是褪黑素和血清素合成前體。色氨酸通過犬尿氨酸途徑產生煙酸和奎林酸，研究發現在腎功能不全患者和CKD 患者中該通路激活導致其代謝產物水平升高[28]。此外，色氨酸在腸道菌群參與下生成吲哚及吲哚衍生物，如吲哚乳酸、吲哚乙酸、硫酸吲哚。其中一些代謝產物（如吲哚乳酸、吲哚乙酸）為芳烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）的配體，AHR 是免疫系統中細胞廣泛表達的轉錄因子，許多研究表明AHR活化以配體特異性方式改變先天性和適應性免疫應答。硫酸吲哚酚是一種毒素積累在CKD 患者中，其血清濃度約為100 μM，而健康成人為2 μM。硫酸吲哚酚是AHR激動劑，其誘導腎小管間質纖維化、腎小球硬化、血管內皮細胞功能障礙和內皮細胞氧化應激[29,30]。精氨酸代謝產物對稱二甲基精氨酸（Symmetric dimethylarginine，SDMA）和不對稱二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）甲基位置不同，卻具有明顯不同生物學特性。由于SDMA在體內被腎臟代謝速度緩慢，所以腎功能障礙將導致該代謝物在血液中水平升高[31]。此外，精氨酸經一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）代謝產生瓜氨酸和一氧化氮。誘導型NOS 在非特異性免疫應答過程中參與一氧化氮的形成，而內皮型NOS 合成的一氧化氮量很少，主要用于刺激血管舒張。ADMA 會抑制內皮型NOS 活性從而抑制一氧化氮的形成和依賴于一氧化氮的血管舒張。內皮型一氧化氮的合成在CKD 中降低[32]。肝臟和腎臟都參與尿素循環過程（也稱為鳥氨酸循環）將氨轉化為尿酸和尿素。尿素循環與多條代謝通路相關，如多胺代謝、一氧化氮合成、檸檬酸循環和精氨酸代謝。研究發現，血漿中瓜氨酸、鳥氨酸和精氨酸水平改變與CKD 發展階段有關。在CKD 晚期，瓜氨酸/精氨酸和鳥氨酸/精氨酸的比值增加[33]。

表1 慢性腎病臨床代謝組學研究相關代謝物列表

續表

檸檬酸循環中間產物：檸檬酸循環也稱為三羧酸循環（Tricarboxylic acid cycle，TCA），是將乙酰輔酶A中的乙酰基氧化成二氧化碳和還原當量的酶促反應的循環系統。乙酰輔酶A 是糖類、脂類、氨基酸代謝的共同中間產物，進入循環后會被分解最終生成產物二氧化碳并產生ATP，提供能量。該循環是多種代謝產物的中心，也在其他路徑中發揮重要作用，如糖異生（草酰乙酸），氨基酸代謝（琥珀酸、酮戊二酸和草酰乙酸）或脂肪酸代謝（乙酰輔酶A）。腎臟功能受損導致尿液中檸檬酸循環水平升高，這種作用在糖尿病腎病中尤為明顯[34]。

脂質：脂質作為轉運或能量中間體和信號轉導前體（如磷脂酰肌醇、類花生酸或神經酰胺）在機體正常生理、病理過程中發揮重要作用。已有研究發現幾種類型脂質可用于心血管疾病、糖尿病、腎病等疾病風險分層和生物標志物。與慢性腎病相關的脂類生物標志物包括脂肪酸、甘油脂類、鞘脂類和固醇類等[35]。

4 小結與展望

近年來，隨著分析技術及生物信息學方法的進步，代謝組學在許多疾病中得到廣泛應用。CKD 及其并發癥代謝組學研究揭示了CKD 發生發展與氨基酸代謝、TCA 循環、脂質代謝等功能障礙相關，為CKD 發病機制和開發新的診斷、治療策略提供了有力的工具[36]。不過代謝組學研究也存在幾個挑戰：①臨床樣本納入標準化。CKD 并發癥較多，如心血管疾病、糖尿病腎病，因此設計回顧性或前瞻性研究時需要明確患者表型特征，才可能將CKD 生物標志物從其他疾病（如代謝綜合征、糖尿病、炎癥、癌癥）中分離出來。②多種代謝組學平臺相結合。迄今為止，只有少數CKD代謝組學研究采用多個分析平臺或多個生物樣本。多種平臺和生物樣本相結合，可以更大范圍發現與CKD 相關的代謝物，從而有利于更進一步篩選其潛在生物標志物，為CKD 提供新的生物學見解。③多種代謝物聯合應用。單一生物標志物應用于疾病診斷具有一定局限性。建議使用一組生物標志物或將生物標志物與臨床指標相結合提高CKD 預測。雖然代謝組學在生物標志物驗證方面取得了突破，但其臨床應用仍處于起步階段。如果這些障礙被清除，那么利用代謝物監測CKD發生發展將成為可能。