滋補脾陰中藥的網絡藥理學機制分析＊

趙春燕，戰麗彬

（南京中醫藥大學中醫學院·中西醫結合學院·中醫脾藏象現代研究實驗室 南京 210023）

“脾陰”一詞最早見于南宋·齊仲甫《女科百問》[1]：“有因冷氣痞結于脾陰，濕郁而為黃”。現代研究表示脾是一個涉及消化吸收、水鹽代謝、能量轉化、血液、免疫及神經內分泌等多系統的綜合功能單位[2]，其病理多表現為涉及多器官、多系統的復雜病理改變。脾陰是脾中水谷精微所化生的營血、津液、脂膏等精微物質，與脾陽一起維持脾臟的正常生理功能。脾臟有病多為虛證，脾陰虛是其常見證候之一。近年來，具有滋補脾陰功效的中藥被廣泛運用于消化系統疾病及癡呆、糖尿病等多種常見病中[3]，雖療效顯著，但其分子機制尚不明確，故本文采用網絡藥理學這種宏觀的研究策略，從系統水平探究和梳理滋補脾陰中藥發揮藥理作用的機制。

網絡藥理學是一種基于系統生物學的新興學科，它通過建立單味中藥或復方和其活性成分以及藥物靶標、生物學通路等網絡的方法從分子層面闡明中藥的作用機制，由于其分析方法符合中醫藥治療模式“多組分”“多靶點”的特點并且可以充分利用網絡資源，成為探索中藥復方的復雜機制[4,5]、單味中藥或中藥配伍禁忌的毒理作用[6,7]、新藥研發[8,9]等新的思路。本文應用網絡藥理學的研究思路預測滋補脾陰方劑中使用頻次較高且歷代醫家對其滋補脾陰功效有明確論述的5 味中藥的活性成分、潛在靶點以及靶點參與的通路，結合網絡拓撲指數分析和分子對接實驗，在分子層面上闡明滋補脾陰中藥的共性機制，為探究滋補脾陰中藥的作用機理提供數據支撐，從而為更加深入的探究脾陰學說提供思路。

1 材料與方法

1.1 代表性滋補脾陰中藥選擇及其活性成分遴選

本文按照以下3個原則（臨床常用中藥，滋補脾陰方劑中使用頻次較高，歷代著述中對其功效由明確記述）篩選出有代表性的滋補脾陰中藥。各味中藥活性化合物來源于TCMSP 數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、TCMID 數據庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）以及文獻。以藥物動力學（Absorption and distribution and metabolism and excretion，ADEM）參數中類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18 作為指標進行篩選，該指標用來評價分子是否含有特定的功能基團或與大部分藥物相同或相似的物理特征，被廣泛用于藥物開發[10]。

1.2 滋補脾陰中藥靶點預測

通過TCMSP 數據庫和STITCH（http://stitch.embl.de/）數據庫獲得成分作用靶點。其中，TCMSP 數據庫中的化合物靶點信息主要來源于DrugBank 數據庫。同時，將查詢到的化合物信息輸入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行查詢，獲得化合物的SMILES 結構式。再將SMILES 結構式輸入STITCH 中進行靶點預測，該數據庫是化合物與蛋白質之間已知或預測的相互作用的數據庫，可利用化學相似性預測化合物靶點。將查詢對象限定為人源基因（Homo sapiens）作為研究對象，選擇Tanimoto score ≥0.9 的檢索結果為相似化合物進行靶點預測。

1.3 滋補脾陰中藥功能網絡構建及節點重要性評價

為明確滋補脾陰中藥靶點間的相互作用關系，將其潛在靶點導入功能蛋白相互作用數據庫（String，https://string-db.org），選擇較高置信度0.800，將蛋白種類限定為人源（Homo sapiens），導出靶點關聯信息，在Cytoscape 3.7.1軟件中導入節點信息進行可視化，僅保留最大的連通片，并用ClusterMaker 插件對網絡中的節點進行聚類排列。獲得蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-Protein interaction，PPI）網絡。

本研究采用PageRank[11]算法評價蛋白在網絡中的重要性，該算法是復雜網絡節點重要性排序的經典算法，作為全局算法的1 種，它的策略可概括為“某1個節點的鄰節點越重要，則這個節點越重要”[12]。將蛋白互作信息導入R軟件（https://www.r-project.org）3.5.3，利用igraph 安裝包構建PPI 網絡并計算每個蛋白的PageRank 值，大于二倍平均值的蛋白被認為是滋補脾陰中藥作用的關鍵靶點。為突出滋補脾陰中藥藥理機制的共性，利用R 軟件查找各中藥間的重合靶點，繪制韋恩圖（VennDiagram 安裝包），5味中藥共同作用的靶點同樣被認為是關鍵靶點。將滋補脾陰中藥關鍵靶點及其來源化合物信息導入Cytoscape 3.7.1 軟件中構建“中藥-化合物-關鍵靶點”網絡。

1.4 京都基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將滋補脾陰中藥潛在靶點數據導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行KEGG 通路富集分析，P ＜0.05 表示具有統計學意義。通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫獲得富集通路的詳細信息。并將最為富集的20 條通路信息導入R軟件（ggplot2安裝包）中繪制氣泡圖。

1.5 滋補脾陰中藥疾病關聯度分析

為明確滋補脾陰中藥在疾病中的應用價值，通過治療靶點數據庫（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/）獲取PageRank 值大于平均值的靶點的相關疾病信息，該數據庫中的疾病帶有ICD-11（國際疾病分類）編碼，基于該編碼對所有疾病分類，利用R 軟件（ggplot2 安裝包）繪制柱狀圖，將各類疾病累計出現的次數可視化。

1.6 分子對接驗證關鍵靶點

分子對接是一種評價藥物活性小分子與靶蛋白結合能力的方法，本實驗采用AutoDock4.2.6（http://autodock.scripps.edu）軟件對5 味滋補脾陰中藥的共同靶點進行半柔性對接。蛋白構象來源于Protein Data Bank（http://www.rcsb.org）數據庫，通過文獻篩選合適的PDB ID。活性化合物MOL2 文件來源于TCMSP 數據庫。首先使用AutoDock Tools（ADT）對蛋白進行加氫、去水和加電荷預處理，并將化合物和蛋白輸出為PDBQT 格式，之后用AutoGrid 計算能量格點，采用遺傳算法對化合物和靶蛋白進行對接，并對其結合能力進行打分。采用Pymol軟件對關鍵化合物和蛋白間的對接結果進行繪圖。

2 結果

2.1 滋補脾陰中藥選擇及活性成分遴選

黃一卓[1]及金景熙[13]等人對古今醫案進行統計，歸納出滋補脾陰方劑中使用頻次較高的中藥（圖1），本研究基于上述數據結合歷代醫家的論述，將山藥、白扁豆、白芍、茯苓及芡實5味中藥納入研究范圍。通過數據庫和文獻檢索及ADME 參數篩選，經過去重后最終得到擁有靶蛋白的69個活性化合物，其中山藥活性成 分22 個，茯 苓18 個，白 芍22 個，扁 豆4 個，芡實8個。

圖1 古今滋補脾陰方劑中使用頻次較高的中藥

2.2 活性成分靶點預測

整合TCMSP 數據庫和STITCH 數據庫中獲得各味中藥潛在的靶點，經上述條件篩選并剔除各自的重復項后獲得山藥潛在靶點83 個，茯苓118 個，白芍149個，白扁豆30 個，芡實80 個，最終共獲得靶點276 個，對各藥味靶點重復情況進行分析（圖2）。中藥間各有重復靶點，其中血管內皮生長因子A（VEGFA）、環氧化酶1（PTGS1）和環氧化酶2（PTGS2）為5 味中藥共同的作用靶點，從而推測以上3 個靶點在這類中藥發揮藥理作用的過程中至關重要。

2.3 滋補脾陰中藥功能網絡構建及節點重要性評價

為直觀表示滋補脾陰中藥作用靶點間的關系，將靶點信息輸入Cytoscape 軟件中構建PPI 網絡圖（圖3），利用PageRank 算法給該網絡中各節點打分，獲得16 個大于二倍平均值的靶點，其中包括RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、信號轉導子與轉錄激活子3（STAT3）、轉錄因子AP-1（JUN）、白細胞介素-6（IL6）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、胰島素（INS）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）等。加上2.2 中篩選出的共同作用靶點，共獲得18個關鍵靶點（表1）。從圖中可看出這些關鍵節點（紅色）分別存在于較大的聚類單位中，處于同一個聚類單位中的蛋白可能具有更強的相互作用并參與同樣的生物學功能。

圖2 滋補脾陰中藥靶點韋恩圖

“滋補脾陰中藥-化合物-關鍵靶點”網絡（圖4）中包含61個節點（5個中藥、38個化合物和18個蛋白）和206 條邊。其中PTGS2 有32 個來源化合物，PTGS1 有21 個來源化合物，說明這2 個靶點在5 味滋補脾陰中藥間存在著確切的共性。熊果酸（ursolic acid）擁有9個關鍵靶點，是網絡中貢獻度最大的化合物。分析網絡中化合物信息（表2）。

圖3 滋補脾陰中藥潛在靶點PPI網絡

表1 滋補脾陰中藥作用的關鍵靶點

2.4 京都基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將滋補脾陰中藥的靶點通過DAVID 及KEGG 數據庫進行通路注釋及分析，得到98 條顯著富集的通路。根據P 值大小，將最為富集的20 條通路用富集點圖表示（圖5），圖中氣泡大小代表通路中富集基因的數目，顏色按照P 值大小依次由紅色向綠色漸變。結果顯示，滋補脾陰中藥主要作用的通路有HIF-1 信號通路、癌癥通路、胰島素抵抗、PI3K-Akt 信號通路、結直腸癌、細胞色素P450 在外源化合物代謝中的作用、花生四烯酸代謝、mTOR信號通路等。

表2 關鍵靶點來源化合物信息

圖4 “滋補脾陰中藥-化合物-核心靶點”網絡

圖5 滋補脾陰中藥潛在靶點的KEGG通路富集點圖

圖6 滋補脾陰中藥潛在作用的疾病統計

2.5 滋補脾陰中藥疾病關聯度分析

查找PPI 網絡中大于PageRank 平均值的99 個靶點的相關疾病，共獲得195 種疾病，按ICD-11 編碼可分為20 類，將頻數＞5 的類別繪制為柱狀圖（圖6）。其 中 腫 瘤（2A00-2F9Z，29.74%）、神 經 系 統 疾 病（8A00-8E7Z，10.77%）、內分泌、營養和代謝疾病（5A00-5D46，7.18%）、消化系統疾病（DA00-DE2Z，7.18%）、肌肉骨骼系統和結締組織疾病（FA00-FC0Z，7.18%）占比較高。在統計結果中，滋補脾陰法治療結直腸癌[18]、乳腺癌[19]等惡性腫瘤，2型糖尿病[20]等內分泌疾病，認知功能障礙[21]、肌營養不良[22]等神經系統疾病及潰瘍性結腸炎[23]、腸易激綜合征[24]等消化道疾病皆可見臨床報道。除此之外，本次實驗結果顯示具有滋補脾陰作用的中藥還可能在食道炎、酒精性肝病、膽石癥、胰腺功能障礙等疾病中有擁有應用潛力，值得從中醫傳統理論和分子生物學等層面展開深入探討。

2.6 關鍵靶點PTGS1/2的分子對接結果分析

對5 味中藥共同調節的靶點VEGFA（PDB ID：4KZN）、PTGS1（PDB ID：5WBE）和PTGS2（PDB ID：3LN1）進行分子對接驗證（表3）。自由結合能＜0 則代表小分子和蛋白間可以自由結合，＜-5表示有較好的結合活性。結果顯示，熊果酸與三蛋白結合活性皆較好，齊墩果酸、β-谷甾醇、β-香樹脂醇乙酸酯、常春藤皂苷元、(-)-花旗松素、玉蘭脂素A、海風藤酮和豆甾醇等化合物與PTGS1/2 結合活性較好，β-胡蘿卜素和薯蕷皂苷元與VEGFA 及PTGS2 結合能力較強。圖7 為熊果酸與PTGS2 的相互作用分子對接示意圖，小分子與氨基酸殘基CLU308、GLY121形成氫鍵。

表3 PTGS1/2與對應化合物的分子對接結果

圖7 PTGS2與熊果酸相互作用分子對接示意圖

3 討論

古今方劑中單純補益脾陰的極少，明確記載有補益脾陰功效的中藥更是寥寥無幾。歷代醫家對各藥味的滋補脾陰之功有不同看法，但大都認為山藥藥效卓著，白扁豆、芡實、茯苓、白芍等藥也皆有文獻支撐。如明代醫家周慎齋在《慎齋遺書》稱：“凡嘈雜，脾陰不足，山藥宜多用”“茯苓、山藥固其脾陰”“芍藥，陰分藥也，通脾經，性味酸寒，能和血，治虛腹痛也”。清代醫家陳其瑞在《本草撮要》中也提到：“山藥味甘，入足太陰經，功專健脾，得羊肉補脾陰，得熟地固腎精”。明代賈所學《藥品化義》：“白茯苓，味獨甘淡，甘則能補，淡則能滲，甘淡屬土，用補脾陰，土旺生金，兼益肺氣”。清·張德裕《本草正義》：“芍藥古無赤白之分，而功用自別，白者冷而微酸，能益太陰之脾陰，而收渙散之大氣”。清·吳澄在《不居集》中論述：“扁豆、谷芽補脾陰，而不燥肺金”。清·王旭高《王旭高臨證醫案》：“加扁豆培養脾陰，土旺自能生金也”。明代張介賓在《景岳全書》中論芡實：“味甘，氣平，入脾腎兩臟。能健脾養陰止湯”。如故最終將以上5 味藥納入研究范圍。

本研究發現滋補脾陰中藥通過大量靶點和通路協同發揮作用，其中環氧化酶、花生四烯酸代謝、細胞色素P450 酶和5-羥色胺等是其影響的一個大的功能聚類單元。環氧化酶（Cyclooxygenase，COX）又稱前列腺素內氧化酶還原酶，是花生四烯酸代謝通路中的關鍵酶。戰麗彬教授[25]指出脾的生理功能之一可概括為肌肉組織、血液系統和免疫功能。而花生四烯酸在血液、肝臟、肌肉等器官和組織中起著重要的生理作用，同時也是合成前列腺素（prostaglandins），血栓烷素（thromboxanes）和白細胞三烯（leukotrienes）等二十碳衍生物的直接前體，對人體造血和免疫調節具有十分重要的意義[26]。在神經系統方面，花生四烯酸被證明直接參與了可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNARE）介導的突觸傳遞[27]，該過程影響神經遞質的釋放，其異常往往會導致神經系統功能的紊亂。細胞色素P450 酶（Cytochrome P450，CYP）也在花生四烯酸肝臟和腎臟中的代謝發揮作用，CYP 是一類廣譜生物催化劑，并可以參與脂肪酸、外源物質、治療藥物和信號分子的代謝，包括二十烷類化合物、白三烯和前列腺素類化合物[28]。滋補脾陰中藥具有6 個CYP 家 族 的 靶 點，分 別 是CYP1A1、CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2、CYP1B1 和CYP4F2。滋補脾陰中藥還能通過CYP 或作用于5-羥色胺轉運體（SLC6A 4）、5-羥色胺受體（HTR3A）等參與5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的代謝過程，這種單胺類神經遞質大量存在于大腦皮層質及神經突觸中，在學習記憶、情緒和內分泌等生理功能以及異常情緒和認知等病理狀態中發揮重要作用。《素問·宣明五氣》曰：“心藏神，肺藏魄，肝藏魂，脾藏意，腎藏志。”因此，脾陰不足可導致脾不藏意，氣血生化無源則腦髓失養，影響正常的認知能力，嚴重可發展為認知功能障礙，戰麗彬教授課題組用滋補脾陰方藥治療糖尿病認知功能障礙動物模型，通過對其展開行為學實驗，證實了補益脾陰的方法對糖尿病認知功能障礙有確切的治療效果[29,30]。

除調節免疫、造血功能和精神情緒外，滋補脾陰中藥還調節胰島素抵抗過程。《靈樞·本臟》曰：“脾脆則善病消癉易傷。”脾胃積熱日久，脾陰虧虛，津液受損，發為消渴。吉訓超[31]等人認為胰島素的功能有賴于脾陽的推動，而胰島素代謝則與脾陰有關。在本研究中，認為滋補脾陰中藥對胰島素抵抗的治療作用與mTOR 信號通路和PI3K-Akt 信號通路有密切關聯，mTOR 通過激活下游效應蛋白S6K1 從而顯著上調胰島素受體底物IRS 的Ser307（302）和Ser636/639 位點磷酸化水平，導致IRS 的降解，引發胰島素抵抗[32,33]。而PI3K/Akt 信號通路是胰島素信息傳導的主要通路，可以通過影響多個分子調整葡萄糖代謝和脂質代謝從而調節胰島素水平[34]。以上可能是滋補脾陰中藥治療2 型糖尿病、肥胖及非酒精性脂肪肝等代謝相關性疾病的分子基礎。

滋補脾陰中藥還在胃腸道腫瘤及消化系統疾病中發揮重要作用。其分子機制可能與HIF-1 信號通路密切相關，低氧誘導因子-1（HIF-1）是調節氧穩態的核心誘導因子，在腫瘤形成中其亞型HIF-1α（HIF1A）通過調節血管內皮生長因子（VEGF）來促進血管內皮細胞的分裂增殖，有利于胃腸道腫瘤血管的生成和浸潤[35]。同時，HIF-1 促進血管生成的作用還有助于重建因疾病損傷的胃腸道黏膜血管[36]。HIF1A能夠誘導多種腸壁保護基因的轉錄，在腸壁中形成保護性黏液層[37]。HIF1A 還與PTGS2等靶點共同參與組織炎癥過程，抑制胃腸道炎癥，實驗證明，HIF1A 和PTGS2 在炎性腸病的腸腔和腺體的上皮細胞等組織中的表達皆顯著增加[38]。潰瘍性結腸炎腸黏膜中PTGS2 呈高表達，并且在炎癥細胞聚集的部位呈強陽性[39]。此外，5-HT在胃腸道中與特異性受體結合后有促進胃液產生、調節胃蛋白分泌、促進胃排空及小腸蠕動等作用[40]。

綜上，本文應用網絡藥理學的研究方法，選取山藥、茯苓、白芍、扁豆、芡實5味中藥作為滋補脾陰中藥的代表進行研究，經過網絡拓撲分析和生物信息學分析發現滋補脾陰中藥發揮作用主要是通過多個靶點和通路，參與人體物質代謝、免疫、造血、炎癥反應等過程，并可以影響神經系統，增強學習與記憶能力。對胰島素抵抗、胃腸道癌變、神經系統及消化系統病變等機體異常狀態和疾病有著多重協同效應。這些發現與人們對脾及脾陰功能的現代認識一致。本次研究為探究滋補脾陰中藥的作用機理提供數據支撐，從而為更加深入的探究脾陰學說提供思路。