基于ceRNA探討白藜蘆醇干預腎透明細胞癌的有效機制＊

謝天琪，裴麗霞，宋亞芳，孫夢珠，趙婷婷，易 越，孫建華

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南京 210029）

腎細胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是臨床高發(fā)的腎皮質(zhì)腫瘤，據(jù)全球癌癥觀測站數(shù)據(jù)顯示，僅2018年新發(fā)病例達40 萬例[1]，其中，惡性RCC 中腎透明細胞 癌（clear cell Renal Cell Carcinoma，ccRCC）約 占70%-85%[2]。臨床多采用手術(shù)切除、消融等治療手段，由于1/3 的患者存在術(shù)后復發(fā)或轉(zhuǎn)移等，同時放化療的臨床療效不顯著，致其死亡率高，預后不佳[3]。研究發(fā)現(xiàn)，基因組序列中不到2%為編碼基因，而非編碼基因則被轉(zhuǎn)錄并形成競爭性內(nèi)源RNA 網(wǎng)絡（ceRNA）調(diào)節(jié)靶標mRNA 的表達[4,5]。研究顯示，長非編碼RNA（lncRNA）與miRNA 等相互作用，調(diào)控肝癌、乳腺癌等細胞增殖、凋亡、遷移、衰老[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，URRCC 作為ccRCC 促瘤lncRNA 調(diào)控組蛋白H3 乙酰化進而增加EGFL7 的表達[9]，而SNHG14 等lncRNA 也會影響ccRCC 的發(fā)生與發(fā)展，其主要機制是特異海綿化miR-203 和 釋 放N-WASP 蛋 白[10]，MRCCAT1 等lncRNA 則通過p38-MAPK 信號傳導通路影響ccRCC 轉(zhuǎn)移[11]。盡管已有部分研究，但其確切機制仍未明確。

中醫(yī)藥防治腫瘤有獨特優(yōu)勢，但由于中藥成分復雜，作用靶點較多，目前機制尚不明確，故而通過網(wǎng)絡藥理學進一步完善理論體系成為研究熱點。盡管已有部分研究對中藥及其活性成分干預ccRCC 進行了挖掘[12]，但機制仍未得到完全的闡發(fā)，且缺乏與ceRNA網(wǎng)絡結(jié)合。傳統(tǒng)中藥虎杖性微寒，味苦，因其長于清熱解毒、散瘀止痛，被廣泛應用于臨床[13]，其藥理機制與分子化合物的研究逐年增多。自虎杖提取出的多酚類化合物白藜蘆醇在抗炎、抗氧化、抗腫瘤細胞生長等方面效果顯著[14-18]，網(wǎng)絡藥理學結(jié)合ceRNA 網(wǎng)絡的系統(tǒng)分析將完善中藥治療ccRCC的理論體系。

本研究通過篩選差異表達基因（difference expressed genes，DEGs）與差異lncRNA（DELs），預測上游miRNA，構(gòu)建ceRNA 網(wǎng)絡，并探討白藜蘆醇干預ccRCC 的有效機制。通過對GEO 基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus）與TCGA 癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas）的原始數(shù)據(jù)集的篩選和分析，利用與預后相關(guān)的DEGs 預測miRNA 與lncRNA，隨后進行加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）提高研究可靠性，構(gòu)建ceRNA 網(wǎng)絡，通過網(wǎng)絡藥理學分析探討白藜蘆醇的作用靶點。研究探討了ccRCC 的生物學機制，并進一步挖掘了白藜蘆醇抑制ccRCC 的潛在機制，為ccRCC 的診斷及治療帶來新思路。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)材料及處理

在GEO 數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載原 始 基 因 數(shù) 據(jù) 集 GSE40435、GSE53757 及GSE66271（表1）。

其中，GSE40435 包含腫瘤組織與癌旁組織各101例，GSE53757 中各72 例，納入GSE66271 各12 例。通過GDC 在 線 工 具（https://portal.gdc.cancer.gov/）從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載基因及l(fā)ncRNA 數(shù)據(jù)，包括538 個腫瘤樣本、72 個癌旁樣本 及530 例 臨 床 樣 本，通 過R 軟 件limma 包，按P ＜0.05，|log2 (FC)| ＞2 篩選DEGs 與DELs。韋恩圖重疊得到可信度較高的DEGs，熱圖由TBtools軟件創(chuàng)建。

1.2 DEGs富集與功能注釋

基因本論（GO）及《京都基因與基因組百科全書》（KEGG）通路富集分析使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）聯(lián)合KOBAS 3.0（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）進行功能注釋，以P ＜0.05 為 截 止 標 準，通 過EasyChart（http://www.ehbio.com）將分子功能（Molecular Function MF）、細胞成分（cellular component CC）、生 物 學 過 程（biological process BP）及通路信息等特征可視化。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建與關(guān)鍵基因選擇

通過STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用信息(protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡，相關(guān)參數(shù)按默認標準設置。使用Cytoscape_v3.7.1（http://apps.cytoscape.org/apps/）可 視化，CentiScape 2.2 插件（http://apps.cytoscape.org/apps/）進行拓撲分析，挑選出節(jié)點度算法閾值2倍的DEGs作為關(guān)鍵基因。

1.4 預后相關(guān)基因的鑒定

將關(guān)鍵基因?qū)隤rognoScan 預后數(shù)據(jù)庫（http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/），以COX-p value值小于0.05為標準，篩選對預后影響較大的基因。

1.5 預測上游miRNA及l(fā)ncRNA

利用TargetScanHuman 7.2（www.targetscan.org/）、miRDB（www.mirdb.org/mirdb/）及miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）[19-21]進行綜合分析，韋恩圖重疊得到上游miRNA，導入starBase 在線數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）預測并篩選共同作用的lncRNA。

1.6 構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡

加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析（Weighted Gene Correlation Network Analysis WGCNA）在本研究中用以鑒定與臨床特征相關(guān)的高度協(xié)同變化[22]的lncRNA 模塊。采用R 軟件WGCNA 包[23]，進行質(zhì)量評估后，根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)并選擇最佳軟閾值（β 值）以接近無尺度網(wǎng)絡分布，使用biockwiseModules 函數(shù)構(gòu)建加權(quán)共表達網(wǎng)絡；拓撲重疊TOM 矩陣由鄰接矩陣轉(zhuǎn)換，進行層次聚類，以plotDendroAndColors 函數(shù)可視化。分析DELs 與530 例臨床信息的關(guān)聯(lián)性，在挑選出的模塊中驗證lncRNA的臨床相關(guān)性。

1.7 構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡

StarBase 數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）用以確定預后相關(guān)的DEGs、靶miRNA 及l(fā)ncRNA，并構(gòu)建相互作用的ceRNA網(wǎng)絡，使用Cytoscape軟件可視化。

1.8 網(wǎng)絡藥理學分析

TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中包括499 種傳統(tǒng)中草藥及其化合物的藥代動力學信息[24]。通過TCMSP 檢索中藥“虎杖”，篩選口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18的具有生物活性的分子；RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）檢索關(guān)鍵靶點蛋白，使用SYBYL-X 2.0 軟件對蛋白晶體結(jié)構(gòu)進行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換與白藜蘆醇的分子對接。

圖1 包含GSE40435，GSE53757，GSE66271及TCGA（KIRC）篩選的DEGs的Venn圖

圖2 ccRCC差異表達基因熱圖

2 結(jié)果

2.1 DEGs和DELs

對TCGA 中ccRCC 數(shù)據(jù)以及GEO 的數(shù)據(jù)篩選后，得到109 個上調(diào)的DEGs 與60 個下調(diào)的DEGs，共計169 個DEGs（圖1），層次聚類熱圖體現(xiàn)表達量（圖2）。lncRNA 數(shù)據(jù)按照相同的截止標準篩選得到1076 個DELs，其中，上調(diào)的DELs 483個，下調(diào)的DELs 593個。

表2 PPI網(wǎng)絡中關(guān)鍵基因節(jié)點

2.2 DEGs功能及通路富集分析

使用DAVID 聯(lián)合KOBAS 3.0 進行GO 和KEGG 富集分析，隨后將MF、CC、BP 及通路信息可視化（圖3）。可視化前10位的生物學過程及信號通路（P ＜0.05）。

GO 富集分析中，DEGs 主要參與了“血管增生”、“藥物反應”、“低氧反應”、“分泌”、“凝血”、“細胞外基質(zhì)組織”、“血小板脫粒”、“受體內(nèi)移”、“鈉離子穩(wěn)態(tài)”及“細胞底物粘附的負調(diào)節(jié)”等；并在“基底外側(cè)質(zhì)膜”、“血微粒”、“細胞外泌體”、“膠原三聚體”、“血小板α顆粒內(nèi)腔”、“質(zhì)膜”、“胞外間隙”、“胞外區(qū)”、“質(zhì)膜組成部分”與“頂質(zhì)膜”等CC 上富集；MF 主要包含“肝素結(jié)合”、“細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分”、“ATP 酶結(jié)合”、“不依賴鈉的有機陰離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活動”、“磷酸吡哆醛結(jié)合”、“相同蛋白結(jié)合”、“受體結(jié)合”、“蛋白質(zhì)同二聚活性”、“轉(zhuǎn)氨酶活性”、“無機陰離子交換活性”等。

KEGG 富集分析顯示，DEGs 與“抗生素的生物合成”、“碳代謝”、“粘著斑”、“補體和凝血級聯(lián)”、“AMPK信號通路”等通路顯著相關(guān)，在“乙醛酸和二羧酸酯代謝”、“醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收”、“金黃色葡萄球菌感染”、“糖酵解/糖異生”、“果糖和甘露糖代謝”等途徑富集。

2.3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建、模塊分析及關(guān)鍵基因篩選

將169 個DEGs 導入STRING，形成包含141 個節(jié)點與459 條邊的PPI 網(wǎng)絡（圖4）。利用CentiScape 插件，按截斷標準大于13挑選得21個關(guān)鍵基因（表2）。

2.4 預后相關(guān)基因鑒定

圖3 ccRCC差異表達基因GO及KEGG富集分析

圖4 ccRCC差異表達基因PPI網(wǎng)絡圖（藍色：DEGs；黃色：關(guān)鍵基因）

PrognoScan 預后數(shù)據(jù)庫進一步篩選（表3）得5 個表達水平與預后呈負相關(guān)的基因，即ALB、CAV1、COL1A2、HRG和IGFBP3。

2.5 上游miRNA及l(fā)ncRNA預測

通過TargetScan、miRDB 及miRTarBase 數(shù)據(jù)庫中檢索確定hsa-miR-25-3p 與hsa-miR-23a-3p 兩個上游miRNA 與COL1A2、HRG 兩個DEGs。StarBase 數(shù)據(jù)庫預測到的11 個lncRNA 與DELs 交集得到SNHG17與AL136040.1。

表3 與ccRCC預后相關(guān)的關(guān)鍵基因

圖5 ccRCC差異lncRNA加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析

2.6 WGCNA分析

對1076 個DELs 質(zhì)量評估后進行WGCNA 分析。利用picksoftThreshold 函數(shù)選擇9 作為權(quán)重參數(shù)，動態(tài)混合剪切得到3 個模塊（圖5），兩個lncRNA（SNHG17與AL136040.1）均存在于yellow 模塊，且此模塊的ME較高，證明兩個lncRNA與ccRCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

2.7 ceRNA網(wǎng)絡構(gòu)建

利用分析得到的lncRNA（SNHG17、AL136040.1），2 個miRNA（hsa-miR-25-3p 與hsa-miR-23a-3p）以及2 個DELs（COL1A2、HRG）構(gòu) 建ceRNA 網(wǎng) 絡，使 用Cytoscape 軟件可視化（圖6），其中HRG 過表達，COL1A2低表達。

2.8 化合物分子-蛋白對接

圖6 ccRCC差異表達基因-miRNA-lnRNA的ceRNA網(wǎng)絡

圖7 白藜蘆醇與HRG及COL1A2分子對接

根據(jù)OB 及DL 篩選確定白藜蘆醇為化合物分子，PDB 數(shù)據(jù)庫中檢索靶點蛋白COL1A2 及HRG，分別得到5CTD、5CTI、5CVA 及6HG7、5VLK、5VBL、5IJR、2VDN、1UJV 化合物分子。SYBYL-X 2.0 軟件分別對5CV 及1UJVA 處理并進行分子結(jié)構(gòu)對接，5CVA 與白藜蘆醇通過三個位點對接，1UJV則存在兩個對接位點（圖7），白藜蘆醇與5CVA 及1UJV 對接打分均良好（3.57，2.75）。

3 討論

由于腎透明細胞癌（ccRCC）對放化療不敏感與易復發(fā)性，致該病預后較差，且相關(guān)研究較少，目前中醫(yī)藥治療ccRCC 的潛在機制尚不明確。本研究構(gòu)建了ccRCC 預后相關(guān)的ceRNA 網(wǎng)絡，并探討了虎杖提取物白藜蘆醇干預ccRCC 的有效機制。通過對比腫瘤組織與癌旁組織篩選169 個DEGs 及1076 個DELs，利用TargetScan、miRDB、miRTarBase 和starBase 三個數(shù)據(jù)庫確定兩個mRNA 及其上游miRNA 與lncRNA，WGCNA 分析使最終建立的ceRNA 網(wǎng)絡更可靠，并通過網(wǎng)絡藥理學分析進行更深一步的探討。

在ccRCC 的發(fā)生，發(fā)展與遷移中，上皮細胞粘附分子、PPAR 等起到的作用已被證實[25,26]。在169 個DEGs 的GO 分析中，血管增生、藥物反應、基底外側(cè)質(zhì)膜等顯著富集。多種信號通路如絲裂原激活的蛋白激酶、過氧化物酶體增殖激活受體等被激活[27-29]；抗生素的生物合成、碳代謝、粘著斑、AMPK 信號通路等亦與侵襲及遷移密切相關(guān)。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一組長度超過200nt 的非編碼序列，曾被認為不具生物功能[6]，近年來逐漸發(fā)現(xiàn)與腫瘤密切相關(guān)[30]。ccRCC 細胞增殖、分級與轉(zhuǎn)移，與lnc-DILC 表達缺失顯著相關(guān)，并導致預后較差[6]；而高表達的SNHG3亦提示較差預后[31]。本研究通過多個數(shù)據(jù)庫確定兩個上游miRNA: hsa-miR-25-3p 與hsa-miR-23a-3p，starBase與GELs篩選出2個lncRNA（SNHG17與AL136040.1），結(jié)合性別、年齡、放療、化療、分期以及生存時間等臨床數(shù)據(jù)進行WGCNA 分析，最終構(gòu)建的ceRNA 網(wǎng)絡則探討了內(nèi)在機制。

隨著ccRCC 的發(fā)病率逐年上升，耐藥性強、術(shù)后復發(fā)率高、五年生存率低[32]等困擾仍未解決，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥逐漸成為治療ccRCC又一選擇[33]。中藥通過多靶點，多途徑協(xié)同影響腫瘤細胞的侵襲、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等，但由于中藥成分復雜，作用機制尚不明確。隨著網(wǎng)絡藥理學與計算機技術(shù)的興起，闡明中藥作用機制將成為可能。虎杖是治療濕熱黃疸、淋癥等疾病的傳統(tǒng)中藥，始見于《雷公炮炙論》，具有清熱解毒,散瘀止痛等功效[34]。研究表明，從虎杖中提取出的白藜蘆醇具抗炎、抑制粥樣硬化、抗氧化等作用[35]，并可抑制胃癌、乳腺癌、腎癌等進展[36，37]。研究顯示，白藜蘆醇通過多個通路與靶點抑制腎細胞癌細胞，如：白黎蘆醇抑制MMP-2 和MMP-9 表達來影響腎癌786-O 細胞[38]；減少腎癌組織新生血管并抑制皮下組織生長[39]，可能是其藥理作用機制之一。本研究利用生物信息學及網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過作用于HRG 及COL1A2 調(diào)控上游miRNA 與lncRNA，影響ccRCC 預后。此外，富集分析發(fā)現(xiàn)血管生成等生物過程與ccRCC發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，在此ceRNA 網(wǎng)絡中上游lncRNA 與miRNA 通過HRG 上調(diào)及COL1A2 下調(diào)，影響ccRCC 預后，同時，白藜蘆醇作用于兩個mRNA靶點干預ccRCC進展。本研究探索了新的ccRCC 腫瘤標志物與白藜蘆醇干預ccRCC 的有效機制，為臨床診斷與治療提供新思路。