祛痰活血方上調(diào)SOCS1抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝損傷＊

朱曉寧，汪 靜，張玉蓉，尹 玥，彭孟云，曾 勇

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 瀘州 646000）

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前全球最常見(jiàn)的慢性肝臟疾病，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪變（Nonalcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及相關(guān)肝硬化、肝癌[1，2]。NASH被認(rèn)為是NAFL 發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的最重要一環(huán)，其發(fā)生主要是由于循環(huán)中游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FAs）異常升高超過(guò)肝臟的氧化和代謝能力，脂質(zhì)在肝細(xì)胞沉積產(chǎn)生大量過(guò)氧化物，通過(guò)激活Myd88依賴途徑的Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）活化Kupffer 細(xì)胞，從而啟動(dòng)NF-κB 凋亡通路，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡[3-6]。有研究顯示[7]，細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白1（Suppressor of cytokine signaling1，SOCS1）過(guò)表達(dá)可直接抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活改善肝臟炎癥。

祛痰活血方是根據(jù)全國(guó)名老中醫(yī)藥專家孫同郊教授“和調(diào)”思想指導(dǎo)下“調(diào)和少陽(yáng)樞機(jī)”治法形成的治療NASH 經(jīng)驗(yàn)方。我們的前期研究證實(shí)[8,9]，該方能明顯改善NASH 患者肝功能，其作用機(jī)制與降低NFκB 表達(dá)有關(guān)。但是，該方如何調(diào)控NF-κB 表達(dá)治療NASH 的具體機(jī)制仍不清楚。因此，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)側(cè)重觀察祛痰活血方通過(guò)調(diào)控SOCS1抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路改善非酒精性脂肪性肝炎肝損傷的作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠30 只，體質(zhì)量（20-22）g，均購(gòu)于四川達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（SCXK（川），2015-030），飼養(yǎng)于恒溫（20± 2）℃，明暗交替各12 h，無(wú)特定病原體環(huán)境下。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

祛痰活血方浸膏制備：祛痰活血方配方（陳皮10 g，茯苓15 g，法半夏10 g，薏苡仁20 g，澤瀉20 g，郁金15 g，丹參15 g，生山楂15 g，柴胡12 g，黃芩10 g，決明子15 g，炙甘草3 g），劑量換算參考人與動(dòng)物之間的體表面積之比。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期的研究結(jié)果[10]，選擇最佳的療效劑量。中藥藥材煎煮、提取、濃縮由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室完成。

試劑：ALT、AST、TC、TG 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，油紅O 染色試劑盒（Solarbio）；總RNA提取試劑盒（天根生物科技（北京）有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）Master Mix（日本Toyobo 公司），引物序列由生工生物（上海）有限公司合成；TLR4、SOCS1、NF-κB 抗體（Abcam公司），Myd88抗體（Santa公司）。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

超低溫冰箱（Thermo 公司）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）、熒光顯微鏡（Nikon）、高速低溫離心機(jī)（Sigma公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf）、全能蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)及凝膠掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Bad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

30 只C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組和祛痰活血方組。正常組給予普通飼料，模型對(duì)照組和祛痰活血方組給予蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料（購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司）。第4周結(jié)束時(shí)，隨機(jī)取模型對(duì)照組和祛痰活血方組小鼠各2只，觀察肝組織病理。確認(rèn)造模成功后，正常組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，祛痰活血方組給予中藥灌胃4 周，給藥期間模型對(duì)照組和祛痰活血方組持續(xù)MCD飼料喂養(yǎng)。

表1 Real-Time PCR引物序列

1.2.2 小鼠一般情況及體質(zhì)量

觀察小鼠食欲、大便及外界反應(yīng)，每周稱體質(zhì)量并登記。

1.2.3 肝臟酶學(xué)及血脂指標(biāo)檢測(cè)

分離血清，測(cè)定ALT、AST、TC、TG含量。

1.2.4 肝組織病理學(xué)與免疫組化

新鮮組織固定脫水包埋后切片，HE及油紅O染色觀察肝臟脂肪變及炎癥程度。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB的表達(dá)。

1.2.5 Real-Time PCR 檢測(cè)小鼠肝組織SOCS1、TLR4、Myd88和NF-κB的表達(dá)

取肝組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Real-time PCR，以β-actin 為內(nèi)參，用比較循環(huán)閾值（CT）的方法進(jìn)行靶基因mRNA 表達(dá)水平的相對(duì)定量。引物由生工生物（上海）有限公司合成（表1）。

1.2.6 Western blot 檢 測(cè) 小 鼠 肝 臟SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB蛋白的表達(dá)

液氮研磨肝組織，冰上裂解30 min，離心收取上清，測(cè)定蛋白濃度，蛋白熱變性后，電泳分離轉(zhuǎn)膜，經(jīng)一抗、二抗孵育洗膜后加入適量顯影液，曝光顯影。

表2 各組小鼠不同時(shí)間體質(zhì)量比較（g，±s）

表2 各組小鼠不同時(shí)間體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與本組前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，△P ＜0.05；與正常組同時(shí)間點(diǎn)比較，▲P ＜0.05；與模型對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P ＜0.05。

組別正常組模型對(duì)照組祛痰活血方組n n 第8周24.79±1.81 13.15±0.58△▲14.01±0.38△▲10 10 10第0周24.32±0.40 23.20±1.08 22.75±0.86 10 8 8第4周26.98±0.47△15.75±0.49△▲16.23±0.37△▲

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料采用±s表示，三組間比較用方差分析和Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況及體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)期間3 組小鼠飲食及排便基本正常，正常組小鼠反應(yīng)迅速，動(dòng)作靈敏，皮毛整潔有光澤；模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量降低明顯，活動(dòng)較少，皮毛油膩；祛痰活血方組中藥灌胃后一般情況有所緩解（表2）。正常組小鼠第4 周較前體質(zhì)量增加（P ＜0.05），第8 周體質(zhì)量較前無(wú)差異（P ＞0.05）；模型對(duì)照組和祛痰活血方組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低（P ＜0.05）。與正常組比較，模型對(duì)照組和祛痰活血方組小鼠體質(zhì)量第4、8 周均明顯降低（P ＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，祛痰活血方組小鼠體質(zhì)量在第4、8 周體質(zhì)量變化無(wú)差異（P ＞0.05）。

2.2 各組小鼠肝臟酶學(xué)及血脂指標(biāo)比較

與正常組比較，模型對(duì)照組ALT、AST、TC、TG 水平均明顯升高（P ＜0.05），祛痰活血方組ALT、AST 水平均明顯升高（P ＜0.05），TC、TG組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。與模型對(duì)照組比較，祛痰活血方組ALT、AST、TC、TG水平較模型對(duì)照組明顯降低（P ＜0.05）（表3）。

2.3 HE染色及油紅O染色觀察小鼠肝病理變化

HE 染色：正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)肝細(xì)胞氣球樣變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)已破壞，可見(jiàn)大量氣球樣變，局部可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；祛痰活血方組小鼠肝小葉炎癥及脂肪變程度較模型對(duì)照組均明顯改善（圖1）。

油紅O 染色：正常組小鼠肝細(xì)胞可見(jiàn)少許點(diǎn)狀紅色脂滴，模型對(duì)照組肝細(xì)胞可見(jiàn)大量大小不等的紅色脂滴，祛痰活血方組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴較模型對(duì)照組減少（圖2）。

2.4 各組小鼠肝臟SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB 的表達(dá)

正常組小鼠肝臟SOCS1 陽(yáng)性表達(dá)，TLR4、Myd88、NF-κB 無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；模型對(duì)照組及祛痰活血方組小鼠肝臟SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB 均陽(yáng)性表達(dá)。與正常組比較，模型對(duì)照組小鼠肝臟SOCS1 陽(yáng)性表達(dá)降低，TLR4、Myd88、NF-κB 表達(dá)升高；與模型對(duì)照組比較，祛痰活血方組TLR4、Myd88、NF-κB 表達(dá)降低，SOCS1表達(dá)升高（圖3-圖6）。

表3 各組小鼠肝臟酶學(xué)及血脂指標(biāo)比較（±s）

表3 各組小鼠肝臟酶學(xué)及血脂指標(biāo)比較（±s）

注：ALT，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST，門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；TC，總膽固醇；TG甘油三酯；與正常組比較，*P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05。

TG/（mmol·L-1）2.04±0.08 2.65±0.16*2.31±0.03△組別正常組模型對(duì)照組祛痰活血方組n 10 8 8 ALT/（U·L-1）44.37±4.52 68.57±1.94*52.50±1.87*△AST/（U·L-1）46.67±5.08 66.60±0.26*52.30±2.96*△TC/（mmol·L-1）7.56±0.24 8.71±0.43*7.61±0.41△

圖1 各組小鼠肝臟HE染色（×200）

圖2 各組小鼠肝臟油紅O染色（×200）

圖3 各組小鼠肝臟SOCS1的表達(dá)（×200）

圖4 各組小鼠肝臟TLR4的表達(dá)（×200）

圖5 各組小鼠肝臟Myd88的表達(dá)（×200）

圖6 各組小鼠肝臟NF-κB的表達(dá)（×200）

表4 各組小鼠肝臟相關(guān)基因mRNA的表達(dá)（±s）

表4 各組小鼠肝臟相關(guān)基因mRNA的表達(dá)（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05

組別正常組模型對(duì)照組祛痰活血方組n 10 8 8 SOCS1 1.23±0.15 2.22±0.34*3.56±0.23*△TLR4 1.00±0.06 2.14±0.17*1.17±0.13△Myd88 0.86±0.24 1.86±0.16*1.33±0.29△NF-κB 0.66±0.14 1.28±0.08*0.81±0.10△

圖7 各組小鼠肝臟SOCS1、TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達(dá)水平

2.5 各組小鼠肝臟SOCS1、TLR4、Myd88 及NF-κB mRNA的表達(dá)

與正常組相比，模型對(duì)照組SOCS1、TLR4、Myd88及NF-κB 的表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）；祛痰活血方組SOCS1表達(dá)顯著升高（P ＜0.05），TLR4、Myd88及NF-κB的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。與模型對(duì)照組相比，祛痰活血方組TLR4、Myd88 和NF-κB 的表達(dá)降低（P ＜0.05），而SOCS1的表達(dá)水平升高（P ＜0.05）（表4）。

2.6 各組小鼠肝臟SOCS1、TLR4、Myd88 及NF-κB 蛋白的表達(dá)

與正常組相比，模型對(duì)照組小鼠TLR4、Myd88 及NF-κB 蛋白表達(dá)升高，SOCS1 蛋白表達(dá)降低，祛痰活血方組SOCS1、TLR4、Myd88 及NF-κB 蛋白表達(dá)升高；與模型對(duì)照組相比，祛痰活血方組TLR4、Myd88 及NF-κB蛋白表達(dá)降低，SOCS1蛋白表達(dá)升高（圖7）。

3 討論

NASH 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度堆積、氧化應(yīng)激、線粒體損傷及Kupffer 細(xì)胞活化等多種因素密切相關(guān)，其中Kupffer 細(xì)胞活化后激活TLR4/NF-κB 通路是NASH 發(fā)生肝損傷的關(guān)鍵因素之一[3,11]。近年來(lái)研究認(rèn)為[12，13]，脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)異常堆積及異常增加的LPS 共同活化Kupffer 細(xì)胞后激活了TLR4/NF-κB 通路，從而釋放大量促炎癥因子引發(fā)肝損傷，最終導(dǎo)致了NASH。本研究通過(guò)復(fù)制MCD 飲食誘導(dǎo)的NASH 小鼠模型觀察祛痰活血方改善NASH 肝損傷作用發(fā)現(xiàn)：模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量明顯降低，肝臟病理顯示大量脂滴、氣球樣變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血清ALT、AST、TC、TG 水平明顯升高，肝組織TLR4、Myd88及NF-κB 的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高，提示小鼠因肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)度堆積發(fā)生了嚴(yán)重的肝損傷。當(dāng)給予中藥灌胃治療后，祛痰活血方組小鼠肝臟炎癥及脂肪變程度明顯減輕，血清ALT、AST、TC、TG 水平明顯降低，肝組織TLR4、Myd88 和NF-κB 的mRNA 和蛋白表達(dá)降低，說(shuō)明祛痰活血方能夠通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路改善NASH小鼠肝損傷。

SOCS1 屬于細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白家族，是一類由細(xì)胞產(chǎn)生并反饋性阻斷細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。目前研究[14]認(rèn)為在Kupffer 細(xì)胞激活后，大量促炎因子的表達(dá)增強(qiáng)會(huì)上調(diào)SOCS1 表達(dá)，進(jìn)而負(fù)反饋TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，從而保護(hù)肝細(xì)胞。而對(duì)于SOCS1對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的作用方式目前有兩種觀點(diǎn)[6]，一種觀點(diǎn)認(rèn)為SOCS1直接干預(yù)TLR4/NF-κB 信號(hào)分子發(fā)揮作用，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為SOCS1 通過(guò)對(duì)不同敏感性的信號(hào)分子作用，進(jìn)而直接或間接的干預(yù)TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮作用。本次研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組TLR4、Myd88 和NF-κB 的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，而SOCS1 的mRNA 表達(dá)有所升高，蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)；經(jīng)中藥灌胃后，祛痰活血方組TLR4、Myd88 及NF-κB mRNA 和蛋白表達(dá)均降低，SOCS1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高。以上結(jié)果說(shuō)明祛痰活血方能夠上調(diào)SOCS1表達(dá)直接抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活。另外，我們推測(cè)模型對(duì)照組SOCS1 的mRNA和蛋白表達(dá)不一致與肝損傷的加重對(duì)基因轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。

孫同郊教授認(rèn)為痰濕郁久成瘀是非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病的始動(dòng)因素，痰性粘滯，濕性陰冷，二者郁積最易阻塞水道，損傷陽(yáng)氣。膽為氣樞，主相火，三焦通調(diào)水道，相火熏蒸，氣布水行，運(yùn)轉(zhuǎn)陽(yáng)氣，溝通表里，是謂少陽(yáng)樞機(jī)。樞機(jī)不利，易生痰瘀，痰瘀互結(jié)，影響肝的疏泄功能則發(fā)病，少陽(yáng)樞機(jī)不利是關(guān)鍵病機(jī)，故創(chuàng)立祛痰活血方治療NASH。該方由陳皮、茯苓、法半夏、薏苡仁、澤瀉、郁金、丹參、生山楂、柴胡、黃芩、決明子、炙甘草組成，其中柴胡、黃芩、法半夏意在和解少陽(yáng)，陳皮、茯苓、生山楂調(diào)和脾胃氣機(jī)，薏苡仁、澤瀉通利水道，郁金、丹參活血化瘀，諸藥合用共奏和解少陽(yáng)、鼓動(dòng)中焦氣機(jī)、活血除濕之功。相關(guān)研究證實(shí)[15，16]，柴胡、黃芩、郁金、丹參具有抑制炎癥介質(zhì)的分泌、清除自由基、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫功能，陳皮、茯苓、法半夏、薏苡仁、澤瀉能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝異常。可見(jiàn)，祛痰活血方調(diào)和少陽(yáng)樞機(jī)不利之功效與降低肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)度堆積和抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫平衡密切相關(guān)，從而發(fā)揮改善NASH肝損傷的作用。

綜上，祛痰活血方具有明確的改善NASH 肝損傷作用，其作用機(jī)制與上調(diào)SOCS1 表達(dá)抑制TLR4/NFκB 信號(hào)通路激活有關(guān)。然而，祛痰活血方如何上調(diào)SOCS1表達(dá)的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探索。