微藻的篩選及分類方法

李文濤 張紅兵 李會宣 史秀英 李磊

摘 要：石化能源枯竭和生態環境的惡化迫使人們必須高度重視能源的清潔和可持續性，而微藻具有生長快、易培養、種類繁多、功能各異等優點為國內外學者所青睞，也是生產清潔可持續生物質的最佳選擇。微藻的篩選、分類、鑒定是研究其生理生化特征的基礎，因此保障篩選、鑒定和分類的準確至關重要。隨著科技的發展，人們對于微藻分類鑒定方法的探索仍未終止。該文闡述了近年來用于篩選純化微藻的方法及其優劣，分析并展望了微藻分類和鑒定的發展方向，旨在為微藻的相關研究提供參考。

關鍵詞：微藻;篩選;分類

中圖分類號 Q939.99文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）05-0026-04

Progress in Screening and Classification Methods of Microalgae

Li Wentao et al.

（Biological Science and Engineering Institute，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China）

Abstract： In recent years，the depletion of petrochemical energy and the deterioration of the ecological environment have forced people to attach great importance to the cleanliness and sustainability of energy. However，microalgae have the advantages of fast growth，easy cultivation，various types and different functions，which are favored by scholars at home and abroad，it is also the best choice to produce clean and sustainable biomass. The screening，classification and identification of microalgae are the basis for studying their physiological and biochemical characteristics，so it is essential to ensure the accuracy of screening，identification and classification. With the development of science and technology，the exploration of microalgae classification and identification methods has not stopped ，in this paper，the methods for screening and purifying microalgae and their advantages and disadvantages are reviewed. The research progress of microalgae classification and identification is analyzed and the reference for microalgae research is provided.

Key words： Microalgae ;Screening ;Classification

18世紀工業革命以來，化石能源的消耗與日俱增，導致生態系統嚴重惡化、環境污染日趨加劇，研發清潔可再生能源成為當務之急。微藻（microalgae）廣泛分布于各類水域中，是一類可以自養的單細胞生物，種類多樣、光合作用效率高、生長速度快，是生態系統中的初級生產者，作為生物能源的開發潛力巨大。西方發達國家已經利用微藻生物質生產生物柴油或生物酒精[1，2]，我國程軍[3]等利用微藻轉化制航油也取得較好效果。除此之外，某些種屬的微藻成分具有很高的藥用價值，其中典型的微藻多糖具有提高機體免疫力的作用，可抗癌、抗衰老、抗疲勞、抗輻射損傷，已經用于醫療保健[4-6]及制作功能食品[7]。另外，微藻也可作為飼料[8]、餌料和食品添加劑[9]，增強營養。更加有意義的是，微藻可以利用污水中的無機、有機等污染物生長，并通過生物積累、生物吸附、生物轉化和生物絮凝等方式減緩污染，實現微藻生長和環境污染治理的耦合，這種方式引起國內外廣泛重視[10-12]，成為近年來微藻養殖和污水處理領域的新趨勢。

微藻種類繁多，能力各異，實現培養優化和環保應用需要探究其理化特性，首先就必須對微藻進行科學篩選和分類，因此有必要討論篩選和分類的傳統方法與現代方法之間的差異，比較其優劣，以便篩選和分類工作能夠快速準確。

1 微藻的篩選

微藻篩選方法與微生物的篩選方法類似，先采用選擇性培養基從基質中進行篩選，然后結合顯微鏡下微藻的形態及理化性質進行初步判斷。隨著電子技術發展，儀器設備的不斷更新，結合儀器進行篩選的先進方法得以建立，使得篩選工作逐步簡化，效率提高。

1.1 傳統篩選方法 傳統篩選方法通常是利用毛細管法、平板法和逐級稀釋法[13]，根據微藻的表型結構、鞭毛有無、顏色等指標來分離樣品中的微藻。但這些因素易受周圍環境條件的影響，而且一些同種類型的微藻也會因自身生長狀態的不同而存在差異，另有一些親緣關系較近的物種差異也較小，如：甲藻門的亞歷山大藻屬的某些種類，僅細胞壁上少數甲片的結構有差別[14]。此外，傳統方法篩選速度慢、周期長，對操作人員的業務素質要求較高，因此這種方法有很大局限性。

1.2 儀器設備篩選方法 傳統篩選方法效率低、盲目性較大、且操作過程繁瑣、費用高，不適于微藻的大批量篩選。為此許多國內外學者開始嘗試借助于先進儀器進行微藻篩選。例如，韓煒[15]等利用96孔板轉盤系統篩選微藻，篩選效果與傳統的篩選方式相比有較好的一致性，且篩選速度快。李青[16]等對產油小球藻（Chlorella zofingensis）進行紫外誘變，經尼羅紅染色后結合流式細胞儀，篩選出高含油的小球藻藻株，實現了對特定微藻的篩選，取得顯著效果。

2 微藻的分類

2.1 傳統分類方法 傳統分類方法依據的是微藻細胞形態、大小、生理等指標特性，但由于不同培養基或不同生長階段的微藻特征有差異，導致判斷標準難以把握，同時這種方法難以正確地揭示一些微藻物種之間的親緣關系，導致在某些微藻屬、種的分類上造成混亂。

2.2 分子生物學方法 分子生物學分類技術中，常用以同工酶和蛋白質以及DNA多態性為基礎進行分析分類[17]。

2.2.1 同工酶和蛋白質分析技術 不同微藻種、屬間，其各酶系統中的同工酶酶譜帶和某些蛋白質的基因型存在差異，因此，依據不同微藻同工酶和蛋白質作為物種的分類方法也是可行途徑[18]，且這2種方法酶帶少而明確，工作量小。但是，同工酶和蛋白質的可標記位點有限，提供的信息較少，且化學成分差異較小不穩定;同時它們易受基因和多種內外環境因素的影響，因此，在某些微藻屬、種的分類和鑒定時，很難得到準確的結果。

2.2.2 DNA多態性分析技術 DNA多態性分析技術是以基因序列為基礎，根據基因序列間差異進行比較、分析確定其分類，該技術最為直接有效。而不同微藻之間的差異是因其基因組DNA堿基序列間不同引起的，因此，只要測出微藻基因組序列，比較其差異，就可以進行分類，其結果可靠、準確性高。但是，微藻的基因組DNA較為龐大復雜，且種類繁多，全部測序耗財、耗力、耗時。而目前所采用的主要手段是從基因組中選擇有代表性的某些片段作為分類標準，通過分析片段間的差異，以確定物種間的遺傳差異，達到準確分類。

目前在基因水平的分類研究中，主要以線粒體基因組（mitochondrial DNA）、葉綠體基因組（chloroplast DNA）和核基因組（nDNA）的基因序列及其內部轉錄間隔區Ⅰ和Ⅱ作為分類依據[14]。例如，許多國外研究者利用mtDNA中的細胞色素c氧化酶基因做藻類分類，通過對細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行系統進化分析，分類效果較好[19-20];但是mtDNA重排率高、突變率低，進化速度慢，鑒別位點有限，在同源性分析上受到一定影響，同時在微藻基因組中的拷貝數低，提取純化困難，所以在微藻分類中應用有限，一般運用于較高等級的分類，如屬間、科間甚至更高。而在藻類cpDNA中，由于序列差異比較大，多數在120～220kb之間，所以研究起來較為方便。實驗表明，任何2種植物之間其cp DNA至少有30%的同源性，同源性越高，它們在分類群中親緣關系就越近[21]。而目前對微藻進行屬及以上水平進行分類時，cp DNA中的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基（rbcL）基因使用者較多，且分類結果可靠[22-24]。核糖體基因功能同源且古老，既含有保守區又含有可變區，且具有高度重復序列，如：編碼核糖體RNA（rDNA）的基因和轉錄間隔區（ITS），因此可作為微藻分類依據。而在核糖體基因分類研究中18srDNA和ITS使用者較多，因其分子大小適合操作，效果顯著，被廣泛應用于微藻分類學研究[25-29]。但是，ITS序列在微藻種內高度保守，而在種間差異較大，適宜于不同種間的分類，不適宜于科及以上水平的分類。

3 其他分類方法

3.1 光譜 微藻色素豐富，種類多樣，色素成分和濃度差異導致其光譜信息，如吸收光譜，熒光光譜和拉曼光譜存在一定差異，根據差異可以反推或間接確定微藻的種類，因此結合化學計量學方法，利用紅外光譜能夠進行微藻的快速鑒定、判別和分類[30]。如Lin[31]等人利用高光譜顯微成像系統鑒定形態相似的銅綠微囊藻，然后使用Fisher算法來識別微藻物種，其敏感性和特異性很高，結果證明了這種方法可以快速方便地對微藻進行分類，并且還可以獲取樣本的數量和空間信息。朱慧云[32]等使用已建立的光譜采集系統可有效地識別4種微藻種，為微藻種的鑒定和分類提供了新的途徑。使用Vis/NIR光譜儀和便攜式光學探針的方法適用于各種微藻物種，是一種快速、精確、無損的檢測方法。

3.2 變性梯度凝膠電泳技術 變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）是一種重要的分子多態性技術，在物種鑒定及浮游生物群落多樣性研究方面有著廣泛的應用[33]，而將DGGE技術運用到微藻鑒定中也有許多研究[34]，通常選擇18S rDNA和28S rDNA的片段或其它區間作為特征區域，通過DGGE電泳，從而獲得微藻的特征性條帶進行微藻分類。通過DGGE技術對藻類的特征區域進行差異性分析，可以達到較好的區分效果，同時根據其條帶強弱還能觀測出樣品中的優勢微類。但是，該技術所需設備昂貴，對實驗室條件有一定的要求，且操作繁瑣，耗時耗力，不適于批量操作。

4 展望

隨著微藻生物應用和微藻功能研究的不斷深入，正確篩選鑒定和分類是基礎，也是一項嚴峻的挑戰。對微藻進行篩選時，平板劃線法雖然操作繁瑣耗時長卻是最可靠穩妥的方法，操作也較為簡單，目前微藻篩選方面需亟待解決的仍然是篩選方法及周期問題。

對微藻分類時，特別是依據形態學特征進行表征時，僅通過普通光學顯微鏡難以觀測其表型結構，而電子顯微鏡價格昂貴，此外，一些微藻形態、大小和表型結構在不同生長期會發生變化或未表露出來，以至于無法做出準確的判斷。目前，對微藻分類多采用傳統分類結合分子技術手段進行，在分子生物學中，線粒體基因組（mitochondrial DNA;mtDNA）、葉綠體基因組（chloroplast DNA; cpDNA）和核基因組（nDNA）的基因序列及其轉錄間隔區3者的方法使用較多，是快速鑒定方法。但是，僅依靠1種判斷依據對近緣種屬間微藻進行分類時，結果會有一定誤差，因此需要選用多個判斷標準，多重比較才能得出較準確的結論。選擇ITS1-2和葉綠體中rbcL以及18sRDNA特征區域作為判斷依據是最經濟有效可行的手段，目前最為廣泛使用。此外，微藻分類研究中，基因組DNA提取不易，試劑盒昂貴，應尋找更為方便快捷的提取基因組方法，或直接利用PCR方法擴增特征區域，使實驗更高效。

對微藻鑒定時，通常先將序列比對，然后構建系統發育樹，分析確定其在遺傳系統中的地位。此外，今后藻類分類學研究不能僅僅局限于尋求新的分子指標，也需要借助當前先進儀器，創新思維并尋求更合適的分類方法，還應該去發現某些藻類特有組分，為藻類分類學研究提供準確依據。

參考文獻

[1]Thompson W，Meyer S，Westhoff P. How does petroleum price and corn yield volatility affect ethanol markets with and without an ethanol use mandate？[J].Journal of applied phycology，2011，39 ：3999-4006.

[2]柴娟.微藻：生產生物燃料的新方法[J].甘肅科技，2019，35（18）：74-75.

[3]程軍，劉建峰，張曦，等.微藻水熱提取油脂經脫氧斷鍵制航油[J].浙江大學學報（工學版），2019，53（02）：214-219.

[4]Priyadarshani I，Rath B. Commercial and industrial applications of micro algae—a review[J].Journal of Algal Biomass Utilization，2012，3（4）：89-100.

[5]馮妮.螺旋藻片治療大腸癌術后脾胃氣虛證25例臨床觀察[J]. 中醫藥導報，2014，20（2）：127-128.

[6]段秀紅，孫建宇.螺旋藻膠囊聯合化療對乳腺癌術后患者的療效[J]. 2014，35（21）：3416-3417.

[7]陳妙瑩，梁英妹，陳清梅，等.功能性微藻乳酸飲料的應用前景[J].輕工科技，2018，34（07）：1-2.

[8]呂子君，姚東林，王超，等.螺旋藻添加劑對豬生長、腹瀉率及肌肉營養的影響[J].江蘇農業科學，2015，43（07）：206-209.

[9]Champenois J，Marfaing H，Pierre R. Review of the taxonomic revision of Chlorella and consequences for its food uses in Europe[J].Journal of applied phycology，2015，27（5）：1845-1851.

[10]刁夢潔，柳杰，王晚晴，等.菌藻共生對污水處理和微藻生物量積累的影響[J].環境工程，2018，36（3）：8-12.

[11]脫金華，任洪艷，劉方舟，等.利用實際市政污水培養小球藻及優化外加碳源[J].應用與環境生物學報，2019（1）：25.

[12]劉祥，楊美娟，散而復，等.不同營養模式下固定化斜生柵藻和普通小球藻氨氮去除能力對比分析[J/OL].環境科學研究：1-10[2020-03-11].https：//doi.org/10.13198/j.issn.1001-6929. 2019.07.21.

[13]Andersen R A，Kawachi M. Microalgae isolation techniques[J]. Algal culturing techniques，2005：83.

[14]甄毓，于志剛，米鐵柱.分子生物學在微藻分類研究中的應用[J].中國海洋大學學報（自然科學版），2006，36（6）：875-878.

[15]韓煒.生物能源微藻的快速篩選及大規模培養[D].上海：上海交通大學，2011.

[16]李青，吳洪，蔡忠貞，等.利用流式細胞儀篩選紫外誘變高含油小球藻[J].中國油脂，2018，43（05）：110-112.

[17]帕麗達·阿不力孜.新疆石榴皮植物雌激素物質基礎及石榴品種RAPD分析研究[D].烏魯木齊：新疆醫科大學，2008.

[18]鄒春靜，盛曉峰，韓文卿，等.同工酶分析技術及其在植物研究中的應用[J].生態學雜志，2003，（6）：63-69.

[19]Ehara M，Inagaki Y，Watanabe K I，et al. Phylogenetic analysis of diatom coxI genes and implications of a fluctuating GC content on mitochondrial genetic code evolution[J]. Current Genetics，2000，37（1）：29-33.

[20]劉清香，王婷，許旭明，等.漢江中下游硅藻群落時空分布及其影響因素研究[J].北京大學學報（自然科學版），1999，8（9）：1443-1447.

[21]桂君，譚曉風.植物分子分類與鑒定綜述[J].生命科學研究，1998，2（4）：253-257.

[22]夏金蘭，劉鵬，萬民熙，等.Chlorella sorokiniana rbcL基因的克隆與序列分析及其與18S rRNA基因在分類學上的比較[J].現代生物醫學進展，2010，（24）：4601-4605.

[23]郭立亮.海洋微藻DNA條形碼基因的評估及環境樣本多樣性分析和定量基因的開發[D].青島：中國海洋大學，2015.

[24]Saputro T B，Purwani K I，Ermavitalini D，et al. Isolation of high lipids content microalgae from Wonorejo rivers，Surabaya，Indonesia and its identification using rbcL marker gene[J]. Biodiversitas Journal of Biological Diversity，2019，20（5）.

[25]Gomez-Espinoza O，Guerrero-Barrantes M，Meneses-Montero K，et al. Identification of a Microalgae Collection Isolated from Costa Rica by 18S rDNA Sequencing[J]. Acta Biológica Colombiana，2018，23（2）：199-204.

[26]Tragin M， Zingone A， Vaulot D. Comparison of coastal phytoplankton composition estimated from the V4 and V9 regions of the 18S rRNA gene with a focus on photosynthetic groups and especially Chlorophyta[J]. Environmental microbiology， 2018，20（2）：506-520.

[27]劉旭東，劉國祥，胡征宇.一株耐受高濃度硫酸鎂單細胞綠藻的分類學鑒定及單鹽脅迫對其生長的影響[J].海洋與湖沼，2016，47（1）：61-70.

[28]Liu Q，Wang T，Xu X，et al. Spatiotemporal Distribution and Its Influence Factors of Diatoms in the Middle and Lower Reaches of Hanjiang River[J]. Beijing Da Xue Xue Bao，2018，54（4）：848-856.

[29]Ferro L， Gentili F G， Funk C. Isolation and characterization of microalgal strains for biomass production and wastewater reclamation in Northern Sweden[J]. Algal research， 2018，32：44-53.

[30]劉京華，陳軍，秦松，等.紅外光譜在微藻領域的應用研究進展[J].光譜學與光譜分析，2019，39（1）：79-86.

[31]Wei L， Su K，Zhu S， et al. Identification of microalgae by hyperspectral microscopic imaging system[J]. Spectroscopy Letters， 2017， 50（1）：59-63.

[32]朱慧云，邵茵，姜麗麗，等.可見/近紅外透射光譜分析[J].廣譜學與廣譜研究，2016，36（1）：75-79.

[33]孫靜.變性梯度凝膠電泳技術在微藻鑒定及浮游植物群落結構研究中的應用[D].青島：中國海洋大學，2016.

[34]邵娟，王朝暉，林朗聰，等.常見赤潮藻類的變性梯度凝膠電泳分析[J].暨南大學學報（自然科學與醫學版），2011（05）.

（責編：張 麗）