水產養殖環境中芽孢桿菌的篩選及生長特性研究

許有燊 陳釗 李霞 李健

摘 要：為了篩選可高效降解養殖廢物的菌株，分析其生長特性，從對蝦工廠化養殖水體中分離出1株芽孢桿菌（Bacillus sp. Strain YS-1），研究了環境因子對其生長的影響。結果表明，芽孢桿菌適宜生長條件為：pH6.5?8.5，溫度25?37℃，鹽度5～15‰，轉速240r/min，葡萄糖濃度0～0.2mg/L，[NH+4]濃度0～2mg/L。最佳培養參數為：溫度32.9℃，鹽度14‰，pH6.9。擬合多元二次回歸模型具有顯著性（P<0.05），失擬檢測結果不顯著（P>0.05），決定系數R2=0.9492，校正系數Adj R2=0.8838，方程擬合效果良好。

關鍵詞：對蝦工廠化養殖;芽孢桿菌;生長;理化因子;響應面模型

中圖分類號 S917.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）05-0041-07

Screening and Optimization of Culture Conditions of Bacillus sp. Strains

Xu Youshen1，2 et al.

（1Dalian Ocean University， Dalian? 116023， China; 2Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China）

Abstract： In order to screen strains that can efficiently degrade aquaculture wastes and analyze their growth characteristics， a strain of Bacillus sp. Strain was isolated from shrimp farmed water， and the effects of environmental factors on its growth were studied. Through single-factor physical and chemical factor experiments， it was found that the optimal growth condition of Bacillus sp. Strain YS-1 is： pH 6.5?8.5， temperature 25?37℃， salinity 5?15‰， speed 240r/min， glucose concentration0～0.2mg/L， NH4+0～2mg/L. The optimal culture parameters of the bacteria were： the temperature 32.9℃， the salinity 14‰，and the pH 6.9.The fitted multivariate quadratic regression model was significant（P<0.05）， and the results of misfit detection were not significant（P>0.05）. The determination coefficient R2 = 0.9492 and the correction coefficient Adj R2=0.8838. The equation fitting effect was better.

Key words： Factory shrimp farming; Bacillus sp.; Growth; Physicochemical factor; Response surface model

水產養殖集約化的快速發展，提升了養殖經濟效益，但養殖系統中過高的污染物負荷使得養殖水環境管控面臨巨大挑戰，特別是殘餌糞便、可溶性有機物、氨氮和亞硝酸鹽超標等污染問題。養殖水體污染不僅會影響水產養殖動物的健康與生長，同時養殖廢水直接排放將導致近岸水域的富營養化，破壞周邊的生態環境，這嚴重阻礙了水產養殖業的可持續發展[1]。據報道，在高密度養殖水體中化學需氧量（Chemical oxygen demand，COD）可達40mg/L以上，氨氮與亞硝酸鹽含量可達10mg/L以上[2-4]。

根據我國《海水養殖排放水要求》規定養殖廢水排放至少需要達到二級排放水要求，即COD不得超過20mg/L，無機氮含量不得超過1mg/L[5]。為了達到養殖廢水排放標準，養殖水體在排放前必須經過一定凈化處理，微生物處理是其中高效且經濟的一種方法。

關于益生菌對養殖水體中的有機物、氨氮和亞硝酸鹽降解的研究此前多有報道，芽孢桿菌是其中常用的細菌。李永芹等[6]將刺參底泥中分離出來的枯草芽孢桿菌，再應用于養殖水體，其氨氮降解率達到81.9%。孟睿等[7]用芽孢桿菌處理羅非魚養殖廢水，6d后COD和亞硝酸鹽降解率分別為50.32%和99.15%;祁自忠等[8]利用枯草芽孢桿菌處理模擬養殖廢水，48h內COD濃度降解率為55.73%。在養殖系統中加入芽孢桿菌可以有效去除廢水中的有機物、無機氮等污染物，維持養殖水體微生態的平衡。所以篩選出適應對蝦工廠化養殖環境的芽孢桿菌菌株具有重要意義。

微生物生長有其最適條件，而微生物生長最適條件往往與養殖環境存在一定沖突。為了縮小養殖環境與益生菌適宜生長條件間的差距，更好的發揮益生菌在水環境調控中的作用，本實驗開展了菌株適宜生長條件的研究，為菌株在水產養殖中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗方法

1.1.1 菌株的分離與篩選 芽孢桿菌分離樣品來自海陽市黃海水產有限公司對蝦工廠化養殖水體，將對蝦工廠化養殖水樣以1∶5的比例接種到富集培養基內，30℃培養24h，將培養好的菌懸液置于80℃水浴鍋中加熱20min，篩選芽孢桿菌。將處理過的菌懸液10倍梯度稀釋，吸取不同濃度的稀釋液，涂布于LB營養瓊脂的平板上，30℃培養36～48h。菌落長出后，根據其培養基上外觀形態特征，挑取單菌落進行純培養，分離純化3代后獲得單一菌株，命名為YS-1菌株。將處于對數生長期的菌懸液與50%甘油1∶1混合，放入-80℃冰箱保存。

1.1.2 菌株鑒定 將純化后的菌懸液置于90℃水浴鍋中加熱10min，再冰浴10min，以破壞細胞結構，釋放其DNA模板。利用16S rRNA基因通用引物，正向引物為27F，反向引物為1492R建立如下反應體系（20μl）：MIX（10μl）、無菌水（6μl）、上下游引物（各1μl）、模板（1μl）、酶（0.1μl）。PCR擴增程序如下：95℃10min，（95℃變性30s，55℃40s，72℃1min）×35循環，72℃延伸7min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測。PCR擴增產物送至上海生工生物工程有限公司測序，將所獲序列在NCBI中進行Blastn同源序列比較，鑒定菌株。

1.1.3 單因素實驗 從-80℃冰箱中取出保藏的菌種，以1%接種量接種到100mL TSB液體培養基中，30℃、120r/min培養12h以活化菌種。將活化好的菌懸液，用無菌水10倍梯度稀釋，涂布于LB營養瓊脂的平板上，同時做3組重復，置于恒溫培養箱中30℃培養24h，計數菌落個數。細菌培養液光密度值（OD600nm）采用IMARK型酶標儀（日本伯樂）測定，溶液酸堿度采用意大利哈納HANNA HI98103型筆式酸度計完成，接種實驗在超凈工作臺內完成。

選取溫度、鹽度、pH、轉速、碳源和氮源6個環境因子做單因素實驗，每個因子設計5個梯度，每個梯度設置3個重復。將活化后菌懸液，以1%接種量接種到100mL培養基中。單因素實驗中，控制其余條件與菌種活化條件相同。其中溫度、鹽度、轉速、pH單因素實驗使用TSB培養基，碳源和氮源單因素實驗使用基礎發酵培養基。基礎發酵培養基：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、pH7.0～7.5。葡萄糖、蛋白胨、NH4CL、NaCl、MgSO4·7H2O和其他化學試劑皆為分析純，其中蛋白胨為北京奧博星生物技術有限責任公司產品，余者皆購自于國藥集團化學試劑有限公司。富集培養基為胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB），由北京陸橋技術有限公司生產。LB營養瓊脂由青島高科園海博生物技術有限公司生產。

pH：采用1mol/L的NaOH和HCL調節TSB培養液的酸堿度，設置5.5、6.5、7.5、8.5、9.5共5個梯度，接種后，30℃、120r/min下培養，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;溫度：設置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃共5個梯度，接種后，120r/min轉速下培養，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;鹽度：向TSB培養基中添加NaCl調整鹽度為5、15、25、35、45共5個梯度，接種后，30℃、120r/min下培養，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;轉速：設置80r/min、120r/min、160r/min、200r/min、240r/min共5個梯度，接種后，30℃下培養，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;碳源：采用10mg/L的葡萄糖溶液配制基礎發酵培養基，設置葡萄糖梯度0、0.01、0.1、0.2、0.5mg/L，接種后，37℃、160r/min下培養，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;氮源：以氨氮替換培養基中蛋白胨，采用10mg/L的NH4Cl溶液配制基礎發酵培養基，設置氨氮梯度0、0.5、1、2、5mg/L接種后，37℃、160r/min下培養，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度。

1.1.4 響應面分析 選擇在實際生產中影響較大的溫度、鹽度、pH 3個因素，依據RSM中Box Behnken中心組合原則，采用Design Expert10.0軟件進行分析。然后選用分析所得的最佳生長復合參數培養，并測定培養12h后培養液的OD600值（n=3）以證實該方法的可靠性。

1.2 數據處理 采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法判斷單因素不同濃度處理組之間的差異，統計分析通過Excel 2016和SPSS 20.0統計軟件實現，差異顯著水平為P<0.05。實驗采用Design Expert 10.0軟件進行數據處理，對溫度、鹽度和pH與芽孢桿菌生長響應值進行二次方程回歸擬合，建立數學模型，用決定系數和回歸方程的校正系數來判斷數學模型的擬合程度，多變量方差分析決定方程的意義[9]。優化得到的實驗條件重復3次，以驗證模型的準確性。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離與篩選 樣品接種于芽孢桿菌富集培養基進行培養，加熱處理后經分離、純化得到菌株。將菌株擴增培養后，涂在營養瓊脂培養基上。該菌株單菌落呈灰白色、外形不規則、菌落邊緣不整齊、表面皺褶較粗糙。

以該菌株DNA為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，獲得大小約1500bp的16S rRNA基因。經Blastn同源序列比較，表明YS-1菌株（MN841924）與Bacillus sp.相似度較高，且與登陸號為MH518191的Bacillus sp.菌株親緣關系最近。MH518191，MK578252，KY621529與該菌株的16S rRNA基因的序列同源性超過99%，構建系統發育進化樹，在細菌系統發育分類學上，可初步將該菌株歸屬芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

2.2 單因素實驗

2.1.1 pH對芽孢桿菌生長的影響 由圖2可知，YS-1菌株在pH為6.5～8.5范圍內生長良好，4h后開始顯著生長，進入對數生長期，7h后菌株生長進入穩定期，其中pH為7.5的實驗組菌株生長最佳，5h后OD600值顯著高于其它組（P<0.05），8h后OD600值穩定在0.8～0.85范圍內。pH為6.5和8.5的實驗組菌株也可生長，8h后OD600值穩定在0.69～0.73范圍內。pH為5.5和9.5的實驗組OD600值實驗過程中無顯著變化，強酸、強堿條件下菌株無法生長。

2.1.2 溫度（T）對芽孢桿菌生長的影響 由圖3可知，YS-1菌株在溫度為30℃～37℃范圍內生長良好，2h后開始顯著生長，進入對數生長期，7h后菌株生長進入穩定期，其中溫度為37℃的實驗組菌株生長最佳，2h后OD600值顯著高于其它組（P<0.05），8h OD600值達到峰值0.89，8～12h內37℃組菌體的OD600值逐漸下降，到12h降至0.82。溫度為30℃的實驗組菌株，2h后開始顯著生長，進入對數生長期，8h后OD600值穩定在0.84～0.86范圍內。溫度為25℃的實驗組菌株，4h后開始顯著生長，進入對數生長期，11h后OD600值穩定在0.91～0.93范圍內。溫度為15℃和20℃的實驗組OD600值實驗過程中無顯著變化，低溫條件下菌株無法生長。

2.1.3 鹽度（S）對芽孢桿菌生長的影響 由圖4可知，芽孢桿菌對鹽度的適應范圍很廣，在0～45‰的鹽度范圍內均可生長，各組從3h開始逐步進入對數增長期。且鹽度越低菌體的生長速度越快，5h各組之間出現顯著性差異（P<0.05），鹽度較高時，芽孢桿菌的生長速度受到抑制;8h時5‰組生長速度最快且達到最大值，菌體的OD600值約為0.84;12h時5‰和15‰組菌體的OD600值均可達到0.85，與其余各組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

2.1.4 轉速對芽孢桿菌生長的影響 由圖5可知，芽孢桿菌的生長速度與轉速成正相關，即轉速越快芽孢桿菌的生長速度越快。各實驗組從5h開始，逐步進入對數增長期;7h后各實驗組之間產生顯著性差異（P<0.05），且轉速越快菌體生長速度越快，240r/min下生長速度最快菌體的7h OD600值達到0.9;至12h各組之間差異極顯著（P<0.01），轉速為240r/min時菌株生長速度最快，12h菌株的OD600約為1.30。

2.1.5 碳源對芽孢桿菌生長的影響 由圖6可知，YS-1菌株在葡萄糖濃度為0～0.2mg/L范圍內生長良好，12h持續增長，12h后OD600值穩定在0.65～0.68范圍內，各實驗組之間不存在顯著差異（P>0.05）。葡萄糖濃度為0.5mg/L的實驗組菌株前期生長迅速，2h菌體的OD600值顯著高于其它各組（P<0.05），但之后生長速度逐漸減慢，3～7h與其余各組之間差異不顯著（P>0.05），8h后菌體的OD600值顯著低于其它各組（P<0.05），OD600值穩定在0.40～0.43范圍內。當葡萄糖濃度過高時，會對芽孢桿菌的生長起到抑制作用。

2.1.6 氨氮對芽孢桿菌生長的影響 由圖7可知，YS-1菌株在NH4+濃度為0～2mg/L范圍內可以生長，12h持續增長，12h后OD600值穩定在0.12～0.13范圍內，各實驗組之間不存在顯著差異（P>0.05）。NH4+濃度為5mg/L的實驗組OD600值實驗過程中無顯著變化，與其余各組存在顯著性差異（P<0.05），高濃度NH4+條件下菌株無法生長。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面分析實驗結果 根據單因素影響實驗結果，我們選擇合適的參數范圍進行3因素3水平響應面設計與實驗，其與結果見表1。利用Design expert 10.0統計軟件對實驗數據進行多元回歸擬合，得到芽孢桿菌培養8h后的OD600值與x（溫度）、x1（鹽度）、x2（pH）之間的二元回歸方程為：

OD600=1.08-4.900E-003x+0.0496x1-0.064x2+5.550E-003xx1+0.0735xx2-0.0411x1x2-0.13x2-0.046x12-0.089x22

對該模型進行方差分析見表2，結果表明，基于OD600值所建立的回歸模型是顯著的（P<0.05），失擬檢測結果不顯著（P>0.05），通過失擬檢測，擬合方程有效。決定系數R2=0.9492，校正系數Adj R2=0.8838，擬合方程滿足有效要求。

表3為回歸模型系數顯著性檢驗結果。由表3可以看出，鹽度和pH的一次效應對芽孢桿菌的生長影響達到極顯著水平（P<0.01），但溫度的一次效應對其生長影響不顯著（P>0.05）;溫度、鹽度和pH的二次效應對芽孢桿菌的生長影響都達到顯著水平（P<0.05）;溫度和pH之間的交互作用對特定生長率的影響達到極顯著水平（P<0.01）。

2.2.2 菌體生長條件的優化 利用Design-Expert軟件對表1的數據進行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖8。等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示2個因素交互作用不顯著，橢圓形表示2個因素交互作用顯著[12]。從圖8可以直觀看出，溫度和鹽度、溫度和pH以及鹽度和pH對芽孢桿菌生長的交互作用顯著。且x、x1、x2都存在極值點，利用Design-Expert軟件對代表菌體濃度的OD600值的二次多項式數學模型解逆矩陣得知，3個因素的最優試驗點（x、x1、x2）代碼值（6.88、14.06、32.87），此時Y取最大值1.12。以響應面分析得到的芽孢桿菌最佳生長條件，做3次平行試驗，驗證試驗結果。試驗結果為1.18與預測相符，響應面分析方法可靠。

3 討論與結論

對蝦工廠化養殖具有更高的養殖密度，與傳統粗放養殖相比可以提高養殖效率、獲取更多的經濟利益，但這必然伴隨著高餌料投喂和嚴重的水體污染[10-12]。養殖水環境迅速惡化，產生的有機污染物和無機氮，對養殖生物有毒害作用。目前，使用微生態制劑已成為水產養殖中調節養殖水環境的重要手段，不但可以控制病害發生，還可以減少污染物的排放[13]。但隨著微生態制劑使用規模不斷擴大，微生態制劑對養殖環境缺少針對性的問題也逐步暴露出來，所以本研究以對蝦工廠化養殖水體為樣品來源，篩選出1株可適用于對蝦工廠化養殖的芽孢桿菌YS-1，并根據16sRNA基因測序，將該菌鑒定為芽孢桿菌。

生物學特性研究表明，源自對蝦工廠化養殖池的芽孢桿菌 YS-1同時對多種理化因子具有廣泛的適應性，可見該菌株具有較強的環境適應能力，可用于擴大培養與廣泛應用。由于菌株YS-1是工廠化對蝦養殖的原生細菌，當作為微生態制劑應用于工廠化環境時，較其它來源的益生菌具有更強的適應能力、可以更有效改善水質。因此，芽孢桿菌YS-1的分離、篩選為對蝦工廠化養殖微生態環境提供了優質的原生菌種，對維持養殖水體微生態平衡具有重大意義。

根據單因素實驗結果可以看出，芽孢桿菌生長適應性較強。YS-1菌株在pH為6.5～8.5均可生長，但綜合多因素條件時，在弱堿條件下生長受抑制，更適宜在弱酸條件下生長。這與之前的研究結果相吻合，已有研究報告表明[14-16]枯草芽孢桿菌在pH 7～9范圍內生長較好，但也有學者表示[17]枯草芽孢桿菌更適宜在弱酸性條件下培養。YS-1菌株在溫度25?37℃間的范圍條件下都能生長，且溫度越高生長速度越快，但溫度達到37℃時，OD600呈現先升高后降低的趨勢，表明菌株在這種溫度下會迅速進入衰亡期。這與之前的研究結果相似，趙達[18]等研究表明35℃為枯草芽孢桿菌的最適生長溫度。YS-1菌株在5～45‰的鹽度范圍內均可生長，在5～15‰的低鹽度條件下生長較快。YS-1菌株在轉速為120～240r/min均可生長，且轉速越快生長速度越快，芽孢桿菌作為好氧微生物，高轉速提供的高溶氧有利于其生長。這與之前的研究結果不同，趙達等[18]研究表明搖床轉速為180r/min時最適宜芽孢桿菌的生長，隨著轉速的繼續增加芽孢桿菌的生長受到抑制。

YS-1菌株在葡萄糖濃度0～0.2mg/L范圍內可以生長，12h菌體的OD600約為0.65，當濃度達到0.5mg/L時芽孢桿菌生長受到抑制，12h菌體的OD600約為0.40。這與之前的研究結果不同，高磊等[19]研究表明表明高C/N更有助于異養微生物的生長，所以在養殖過程中加入蔗糖，提高碳氮比。本實驗與其結果不同原因可能是培養基條件簡單，葡萄糖濃度影響溶液滲透壓抑制了芽孢桿菌的生長。YS-1菌株在NH4+濃度0～2mg/L范圍內時，芽孢桿菌可以生長，當NH4+濃度達到5mg/L時，芽孢桿菌無法生長，說明當氨氮作為唯一氮源時，高濃度氨氮對芽孢桿菌有抑制作用。具有脂溶性的分子氨易透過膜結構進入細胞內，引起細胞死亡[20-21]，所以高濃度的NH4+濃度對芽孢桿菌有抑制作用。

溫度、鹽度、pH、轉速及營養物質等多種理化因子對芽孢桿菌的生長都具有不同程度的影響，對其進行系統研究有助于深入了解芽孢桿菌在對蝦工廠化養殖微生態系統中的生存生長條件。自20世紀70年代，科學界逐漸重視溫度、鹽度和pH這3種因子的作用[22-23]。郝林華等[24]采用單因素分析法研究了溫度、pH和多種營養物質對芽孢桿菌生長的影響。而本研究不但分析了這6種因子的單因素作用效果，還選擇3種在實際養殖中起決定性作用的因素，采用響應面分析法建立了多因素復合作用下芽孢桿菌的生長模型，獲得了該菌的最佳培養參數。已有研究表明，使用響應面分析法優化微生物培養條件，可以有效提高目的產物的產量。李志華[25]使用響應面分析法對谷氨酸棒桿菌的培養條件進行了優化，有效提高了谷氨酸產量;黃麗金等[26]采用響應面分析法對德氏乳桿菌的培養條件進行了優化，產出菌液濃度提高了5倍。本實驗結果表明，芽孢桿菌的最優培養條件為：pH 6.88、溫度32.87℃和鹽度14.06‰;此外，二次回歸模型具有顯著性（P<0.05），失擬檢測結果不顯著（P>0.05），方程通過失擬檢測，表明擬合方程有效。決定系數R2=0.9492，校正系數Adj R2=0.8838，說明本實驗所建響應面分析是可靠的。響應面分析法可以減少實驗次數，同時考慮多因素之間的交互作用，擬合多元二次函數，直接反映因子與響應值之間的關系[27]。因此，新方法更直觀的預測對蝦工廠化養殖中環境因子的改變對芽孢桿菌生長動力學的影響。

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（責編：張 麗）